柿及其部分近緣種mtDNA和cpDNA多態(tài)性分析.pdf

1、柿為柿科柿屬植物。本試驗(yàn)基于胞質(zhì)基因組，包括線粒體基因組和葉綠體基因組具有母性遺傳等特點(diǎn)，分別對(duì)柿及其部分野生近緣種材料涵蓋了7個(gè)種(柿；君遷子；浙江柿；油柿；金棗柿；老鴉柿；美洲柿)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，以期從胞質(zhì)基因組。DNA水平上明確柿品種、種的親緣關(guān)系和分類(lèi)地位，為柿屬植物資源利用提供科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)果如下： 1．應(yīng)用在其他高等植物開(kāi)發(fā)的34對(duì)mtDNA特異引物，對(duì)柿屬植物6個(gè)近緣野生種及柿種下20個(gè)品種線粒體基因非編碼區(qū)。

2、DNA序列進(jìn)行．PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：1)選用的32對(duì)引物能擴(kuò)增線粒體基因間隔區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域，并檢測(cè)到110個(gè)變異位點(diǎn)，說(shuō)明mtDNA在序列進(jìn)化和基因重組過(guò)程中存在大量變異；2)其中23對(duì)引物能檢測(cè)到栽培柿種下擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)，聚類(lèi)分析表明原產(chǎn)中國(guó)甜柿種質(zhì)和日本甜柿種質(zhì)完全分開(kāi)，兩者可能具有不同起源；3)中國(guó)原產(chǎn)甜柿寶蓋甜柿和鄂柿一號(hào)具有部分特異譜帶，根據(jù)線粒體基因組母系遺傳規(guī)律，推斷其可能具有相同母本。 2．應(yīng)用10對(duì)葉綠體DNA

3、通用引物對(duì)柿屬植物6個(gè)近緣野生種和柿種內(nèi)23個(gè)品種的葉綠體基因組非編碼區(qū)DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。共擴(kuò)增柿屬植物cpl)NA約20.4 kb，占其葉綠體基因組12.7％。擴(kuò)增產(chǎn)物分別應(yīng)用7種限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果表明：1)cpDNA在柿屬植物中存在豐富的種間多態(tài)性，但柿種各基因型未能檢測(cè)到明顯的遺傳變異位點(diǎn)，僅在trnS-trnfM/RsaI組合檢測(cè)到雄株9號(hào)位點(diǎn)變異；2)栽培柿酶切譜帶模式與4倍體老鴉柿和6倍體美洲柿差異

4、明顯，而與君遷子差異最小。3)應(yīng)用NTSYS程序中主坐標(biāo)分析和PHYLIP中Wagner簡(jiǎn)約法分析得出，在柿進(jìn)化過(guò)程中2倍體的君遷子、浙江柿親緣關(guān)系較近，而與多倍體的美洲柿和老鴉柿卻相距甚遠(yuǎn)；4)金棗柿產(chǎn)生與柿屬植物其他種不同的譜帶模式，綜合形態(tài)學(xué)特征推斷其為柿的一個(gè)新近緣種。 3．應(yīng)用通用引物擴(kuò)增10個(gè)柿屬基因型(包括9個(gè)柿品種和1個(gè)近緣種)葉綠體基因組trnS-trnfM區(qū)域，克隆測(cè)序得長(zhǎng)度為1155bp～1160bp的核苷

5、酸序列，包含trnS，psbZ，trnG和trnfM基因編碼序列及其基因間隔區(qū)序列。共檢測(cè)出17個(gè)序列突變位點(diǎn)，包括11個(gè)堿基替換，3個(gè)堿基插入和3個(gè)堿基缺失位點(diǎn)。供試中國(guó)原產(chǎn)柿品種突變位點(diǎn)2個(gè)，日本原產(chǎn)柿品種為14個(gè)，差異顯著。相對(duì)古老的柿品種此區(qū)域序列保守且高度同源，而近期選育出的陽(yáng)豐變異水平最高，部分變異位點(diǎn)與母本富有相同。鄰接法分析結(jié)果表明原產(chǎn)中國(guó)的柿種質(zhì)與日本柿種質(zhì)分別聚類(lèi)，推測(cè)兩者具有不同起源。序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均表

6、明中國(guó)原產(chǎn)完全澀柿磨盤(pán)柿與完全甜柿寶蓋甜柿和鄂柿1號(hào)起源親本親緣關(guān)系較近。 4．應(yīng)用mtDNA通用引物特異擴(kuò)增柿線粒體基因組ORF25區(qū)域，并對(duì)目的片段進(jìn)行克隆測(cè)序，通過(guò)序列比較檢測(cè)柿品種間mtDNA ORF25區(qū)域序列多態(tài)性，鑒定目的片段為特異擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明此區(qū)域存在部分堿基變異位點(diǎn)，且發(fā)生了序列拷貝。系統(tǒng)分析表明不完全甜柿禪寺丸和不完全澀柿平核無(wú)分化時(shí)間較短。選取中國(guó)和日本不同脫澀類(lèi)型、不同倍性的柿屬植物對(duì)12對(duì)cpSS

7、R引物進(jìn)行通用性檢測(cè)，并初步探究其應(yīng)用潛力。來(lái)源于柑橘類(lèi)ARCP4，ARCP5，ARCP9和來(lái)源于煙草ccmp3，NTCP9，NTCP40的6對(duì)cpSSR引物能夠在供試材料中擴(kuò)增得到目的片段。結(jié)果表明，在其他作物開(kāi)發(fā)的cpSSR引物具有較高的通用性，在柿屬植物的葉綠體基因組研究領(lǐng)域具有潛力。 5．以完全澀柿磨盤(pán)柿為母本，授以完全甜柿羅田甜柿花粉，進(jìn)行大田雜交育種。熒光顯微鏡檢測(cè)花粉與柱頭親和性，應(yīng)用胚挽救技術(shù)對(duì)所得到的種子進(jìn)行幼

8、胚培養(yǎng)獲得雜交后代植株。應(yīng)用RAPD和SSR分子標(biāo)記對(duì)F<,1>代遺傳分析，并與原產(chǎn)中國(guó)部分甜柿種質(zhì)比較。羅田甜柿花粉在磨盤(pán)柿柱頭上可以萌發(fā)，但大多數(shù)產(chǎn)生胼胝質(zhì)塞，親和力較低，僅有少量正常受精。磨盤(pán)柿為單性結(jié)實(shí)，并具有有性雜交能力。在磨盤(pán)柿×羅田甜柿186個(gè)人工授粉處理中共得到82個(gè)果實(shí)，13個(gè)種子；RAPD和SSR檢測(cè)結(jié)果表明所獲得的幼胚培養(yǎng)植株為其F<,1>代，部分單株與寶蓋甜柿和鄂柿1號(hào)等中國(guó)現(xiàn)有甜柿種質(zhì)擴(kuò)增圖譜部分位點(diǎn)相同。

9、 綜上所述，本研究應(yīng)用通用引物特異擴(kuò)增部分柿屬植物的胞質(zhì)基因組，包括線粒體基因組和葉綠體基因組的部分區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物直接通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)、限制性內(nèi)切酶酶切和克隆測(cè)序比較供試材料的遺傳多態(tài)性，并應(yīng)用UPGMA、主坐標(biāo)分析和Wanger簡(jiǎn)約法進(jìn)行聚類(lèi)，分析遺傳關(guān)系。胞質(zhì)基因組所反映的材料間的遺傳關(guān)系與總基因組多種分子標(biāo)記分析結(jié)果大致相同。分析結(jié)果表明：1)柿mtDNA存在豐富變異；2)cpDNA PCR-RFLP可適用柿屬植物種間水平系