FHL3與MyoD和pCREB蛋白相互作用差異調控MyHC各亞型基因表達的分子機制.pdf

1、不同肌肉纖維類型肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain，MyHC)亞型基因是目前公認的區(qū)分不同肌纖維類型的分子標記，因此發(fā)現(xiàn)調控MyHC亞型基因的表達調控機制，對提高肉質性狀和肉品質具有重要的意義。FHL3蛋白屬于LIM蛋白超家族成員之一，不能結合DNA啟動子序列，只能通過結合其它轉錄因子調控下游基因表達。迄今為止關于FHL3是否調控MyHC各亞型基因表達還未見報道。本研究以小鼠C2C12成肌細胞為模型，展開了FHL3對四種

2、MyHC亞型基因的影響及其調控的分子機制的研究，取得了如下主要研究結果:
　　1.利用構建的FHL3超表達載體pcDNA3.1-FHL3和針對FHL3基因的干涉(siFHL3)片段轉染C2C12成肌細胞，采用實時定量PCR、Western blotting、和免疫熒光技術檢測了超表達和干涉FHL3基因前后MyHC各亞型基因表達變化;發(fā)現(xiàn)了FHL3對MyHC2a和MyHC2b有正調節(jié)作用，對MyHC1/slow有負調節(jié)作用，而對My

3、HC2x無影響。
　　2.開展了共轉染試驗，首先利用pcDNA3.1-FHL3和MyoD干涉片段共轉C2C12細胞，發(fā)現(xiàn)干涉MyoD同時超表達FHL3后MyHC2a，MyHC2b蛋白水平仍有顯著增加，而MyHC1/slow表達水平卻沒有顯著變化。之后利用pcDNA3.1-MyoD和FHL3干涉片段共轉染C2C12成肌細胞進一步驗證，發(fā)現(xiàn)干涉FHL3后，增強了MyoD超表達對MyHC1/slow基因表達的促進作用。以上結果表明FHL

4、3主要通過抑制MyoD轉錄活性下調MyHC1/slow基因表達，而對MyHC2a，MyHC2b基因的表達調控可能存在其它機制。
　　3.開展了MyHC2a啟動子區(qū)域缺失片段與pcDNA3.1-FHL3共轉染C2C12成肌細胞試驗，發(fā)現(xiàn)FHL3超表達顯著提高了含有環(huán)化的AMP反應元件(cyclicAMP-responsive elements，CRE)的啟動子活性，在此基礎上，通過CREB超表達和干涉試驗驗證了CREB能夠促進MyH

5、C2a基因表達。
　　4.開展了pcDNA3.1-FHL3和CREB干涉片段(siCREB)共轉染細胞試驗，驗證了FHL3是通過CREB蛋白調控MyHC2a基因表達，并且磷酸化CREB(pCREB)在調控MyHC2a基因表達中發(fā)揮著主要作用;利用免疫沉淀技術驗證了FHL3可以與CREB、pCREB、MyoD及其共轉錄激活因子p300相互結合，當MyoD和pCREB兩種蛋白共同存在的情況下，F(xiàn)HL3與pCREB的結合能力更強。

6、>　　5.利用EMSA和ChIP技術檢測了CREB與MyHC2a基因啟動子CRE元件的結合能力。結果表明非磷酸化的CREB與pCREB都能結合MyHC2a啟動子上的CRE結合元件，但以pCREB結合為主，并且FHL3基因干涉后顯著降低了pCREB與MyHC2a啟動子的結合能力。
　　綜上所述，F(xiàn)HL3對MyHC2a和MyHC2b基因的表達具有正調節(jié)作用，對MyHC1/slow基因表達有負調節(jié)作用;FHL3通過抑制MyoD轉錄活性下