Angiogenin及其與FHL3的相互作用調(diào)控人星形膠質(zhì)瘤病情進(jìn)展的分子機(jī)制研究.pdf

1、血管生成素(Angiogenin,Ang)是第一個(gè)來(lái)源于腫瘤同時(shí)具有血管生成能力的蛋白,Ang在很多疾病中的表達(dá)水平上調(diào),但不是腫瘤特異性產(chǎn)物,其功能也不僅僅局限于促進(jìn)血管生成,越來(lái)越多的研究表明其在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡方面也起到了重要的作用。Ang可能通過內(nèi)皮細(xì)胞上的假定受體參與信號(hào)通路的活化從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖,也能在多能性p19鼠胚性癌細(xì)胞(pluripotent P19 mouse embryonal carc

2、inoma cells)中通過Bcl-2和NF-κB通路起到抗凋亡作用,并能夠定位于細(xì)胞核中參與對(duì)細(xì)胞的調(diào)控。
　　神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤中最常見的類型,而人星形膠質(zhì)瘤在各類神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤中最多見(75％),多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是惡性度最高的腦膠質(zhì)瘤。目前即使有多種治療方法但預(yù)后仍是很差,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在不同的顱內(nèi)腦瘤中都能檢測(cè)到Ang的表達(dá),而在低級(jí)別星形

3、膠質(zhì)瘤中表達(dá)最低,并且Ang對(duì)于膠質(zhì)瘤的惡性轉(zhuǎn)換起到重要作用。我們利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了Ang在星形膠質(zhì)瘤各級(jí)別組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其與疾病的惡性程度呈正相關(guān)。U87MG細(xì)胞屬于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,MTT實(shí)驗(yàn)表明Ang能夠促進(jìn)U87MG細(xì)胞的增殖,并且上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL及促癌基因c-myc的表達(dá)。
　　在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性演變過程中,胞內(nèi)多種信號(hào)分子的表達(dá)均可能通過影響相關(guān)信號(hào)通路的變化,加速或延緩病情進(jìn)展。NF-κB

4、在GBM中是活化的狀態(tài),并在GBM中參與細(xì)胞的存活、增殖及遷移。在不同級(jí)別的星形膠質(zhì)瘤組織中,隨著級(jí)別的升高,ERK1/2及p38的磷酸化也升高,表明這兩條通路在星形膠質(zhì)瘤中也是活化的。為進(jìn)一步探討U87MG細(xì)胞中Ang促進(jìn)細(xì)胞增殖是否與GBM中活躍的信號(hào)通路相關(guān),我們用不同濃度的Ang體外刺激U87MG細(xì)胞,結(jié)果表明其促進(jìn)了p38和NF-κB通路的活化,但是沒有影響ERK1/2的磷酸化,而分別阻斷p38及NF-κB通路,結(jié)果表明Ang

5、能夠通過活化NF-κB通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖。同時(shí),Ang能夠進(jìn)入U(xiǎn)87MG細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),阻斷Ang的入核部分抑制了Ang促進(jìn)的細(xì)胞增殖。以上結(jié)果提示,Ang參與信號(hào)通路的調(diào)控并通過其核內(nèi)的作用促進(jìn)U87MG細(xì)胞的增殖。
　　那么,Ang在星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制在其他腫瘤細(xì)胞中是否存在,我們選擇HeLa細(xì)胞系進(jìn)行比較。我們已知Ang能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖并且進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與其在U87MG細(xì)胞中所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)一致。但Ang

6、是否參與HeLa細(xì)胞中信號(hào)通路的調(diào)節(jié)尚不清楚。結(jié)果顯示,Ang可以通過活化ERK通路促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖。同時(shí),Ang在血液方面惡性腫瘤中的作用還不明確,其中惡性淋巴瘤是目前發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一,而B非霍金式淋巴瘤(B-NHL)約占惡性淋巴瘤的60%。結(jié)果顯示,Ang在B非霍金式淋巴瘤(B-NHL)患者的外周血中的表達(dá)與正常人沒有明顯差異。高濃度的Ang反而抑制了淋巴瘤細(xì)胞Ramos的增殖及NF-κB、ERK通路的活化。以上結(jié)

7、果提示,Ang在不同細(xì)胞內(nèi)及腫瘤內(nèi)對(duì)于信號(hào)通路的調(diào)控并不一致,這一現(xiàn)象為更好的闡述Ang對(duì)星形膠質(zhì)瘤的調(diào)控提供了有效的比較及分析。
　　為了更好的闡明Ang的表達(dá)水平與星形膠質(zhì)瘤病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)及調(diào)控的分子機(jī)制,我們對(duì)前期篩選出來(lái)的Ang相互作用蛋白FHL3進(jìn)行了GSTpull-down及CoIP實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。FHL3(four and a half LIM domains protein 3)屬于LIM蛋白質(zhì)超家族成員,可以通過LI

8、M結(jié)構(gòu)域與蛋白發(fā)生相互作用,并且FHL3能夠通過Smads介導(dǎo)的信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外,FHL3能夠與ERK2相互作用,參與對(duì)ERK通路的調(diào)控。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FHL3的表達(dá)水平與星形膠質(zhì)瘤的病情進(jìn)展呈負(fù)相關(guān),且高濃度的FHL3能夠抑制U87MG細(xì)胞的增殖,但是在FHL3敲低的情況下,沒有影響p38及IκBα的磷酸化,反而促進(jìn)了Ang誘導(dǎo)的信號(hào)分子的活化、Ang的入核及Ang促進(jìn)U87MG細(xì)胞的增殖。這表明FHL3能夠通過調(diào)控An

9、g活化的信號(hào)通路及Ang的入核從而參與Ang促進(jìn)的U87MG細(xì)胞的增殖。而在HeLa細(xì)胞中,敲低FHL3的表達(dá)卻能夠抑制Ang促進(jìn)的ERK1/2的磷酸化,同時(shí)抑制Ang的入核及Ang促進(jìn)的Ang結(jié)合元件(ABE,ctctctctctctctctccctc)的轉(zhuǎn)錄激活活性,最終抑制了Ang促進(jìn)的HeLa細(xì)胞的增殖。這表明FHL3也能夠通過參與Ang調(diào)節(jié)的信號(hào)通路及其核作用參與Ang促進(jìn)的HeLa細(xì)胞的增殖,但是卻起到了與在U87MG細(xì)胞中

10、相反的作用。以上結(jié)果提示在不同的腫瘤細(xì)胞中,FHL3參與介導(dǎo)Ang功能的機(jī)制不同。
　　由于FHL3參與Smad通路的調(diào)控,但是在U87MG細(xì)胞中很難檢測(cè)到本底水平的Smad2的磷酸化,我們利用Smad通路激活因子TGFβ1來(lái)更好的研究Ang的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果意外的發(fā)現(xiàn),在U87MG細(xì)胞中,TGFβ1抑制Ang的表達(dá)和ERK1/2的磷酸化及Ang誘導(dǎo)的p38的活化,這一結(jié)果提示,雖然Ang沒有直接參與Smad2的磷酸化,但是其與TG

11、Fβ1之間的關(guān)系能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究Ang可能的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。而在HeLa細(xì)胞中,Ang可以有效的抑制Smad2的磷酸化,但是TGFβ1沒有抑制Ang的過表達(dá),反而是Ang抑制了TGFβ1促進(jìn)的Smad2的磷酸化,這為Ang促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖又提供了一條線索。
　　由于Ang具有核糖核酸酶及轉(zhuǎn)錄因子活性,我們選擇microRNAs(miRNAs)及其與Ang的反饋調(diào)節(jié)進(jìn)一步探討Ang調(diào)控星形膠質(zhì)瘤可能的分子機(jī)制。MiRNAs是一

12、類內(nèi)源性的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標(biāo)基因3′UTR的完全或不完全配對(duì),降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯,從而參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝和腫瘤轉(zhuǎn)移。MiRNAs在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能特別是血管生成方面有重要作用。我們通過生物信息學(xué)篩選出對(duì)Ang有調(diào)控作用的miRNAs,qPCR檢測(cè)Ang在U87MG細(xì)胞的表達(dá),同時(shí)選擇HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞及HUVEc細(xì)胞進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示只有在HUVEc中miR

13、409-3p能夠在mRNA及蛋白水平抑制Ang的表達(dá)。
　　另一方面,由于Ang具有胰核糖核酸酶活性,能夠催化rRNA的28S和18S的剪切。同時(shí)Ang可能作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控,其入核后與DNA結(jié)合并促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄,并且從rRNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)克隆得到一段與Ang結(jié)合的序列ABE。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示HeLa細(xì)胞中Ang可促進(jìn)ABE序列的啟動(dòng)子活性,且ABE表現(xiàn)出依賴Ang的啟動(dòng)子活性,這表明Ang可能具有轉(zhuǎn)錄因子活性。我們

14、經(jīng)BLAST分析,選取部分有研究意義的基因,分別調(diào)取了其5’上游2000bp以內(nèi)含有7個(gè)以上CT重復(fù)序列的部分片段,經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)了Ang對(duì)這些啟動(dòng)子序列的影響,發(fā)現(xiàn)黑皮質(zhì)素3受體(melanocortin 3 receptor,MC3R)的部分啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄激活活性受到Ang的上調(diào),這表明Ang可能會(huì)調(diào)控MC3R的表達(dá)。我們利用Ang刺激細(xì)胞,提取miRNAs,qPCR檢測(cè)預(yù)計(jì)的可能受Ang調(diào)控的miRNAs的表達(dá)水平,結(jié)

15、果發(fā)現(xiàn)只有miR17-3p在U87MG細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HUVEc中的表達(dá)水平一致,都受到了Ang明顯的抑制,并且miR17-3p在星形膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平低于正常組織。以上結(jié)果提示Ang在U87MG細(xì)胞中下調(diào)miR17-3p的表達(dá)將為深入了解Ang調(diào)控星形膠瘤的發(fā)生發(fā)展提供線索。
　　綜上所述,Ang及其與FHL3的相互作用和miRNAs與Ang反饋調(diào)節(jié)的研究不僅為探討Ang調(diào)控星形膠質(zhì)瘤抗凋亡的分子調(diào)控機(jī)制提供新理論和線索