芥菜開花調控蛋白AGL24與SOC1基因相互作用的分子機制.pdf

1、芥菜是我國南方廣泛栽植的十字花科蔬菜作物，開花時間的早晚將會影響產品器官的產量與品質。雖然在模式植物擬南芥中已分離出大量與開花相關的基因，但是，在蔬菜作物芥菜上這些同源基因是否具有相似的功能，它們調控芥菜開花時間的分子機制究竟如何，目前并不清楚。迄今為止，有關芥菜AGL24蛋白與SOC1基因之間的作用機制仍未見報道。
　　為了研究芥菜AGL24蛋白與SOC1基因的互作機理，本試驗通過酵母單雜交體系和雙螢光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測了芥菜

2、SOC1啟動子的全長、截短體（含CArG-box基序的3個SOC1小片段）、突變體（CArG-box基序突變后的小片段）分別與AGL24蛋白之間的相互作用，從而篩選SOC1啟動子與AGL24蛋白的結合區(qū)域。此外還利用農桿菌介導AGL24轉化芥菜，從體內驗證轉基因植株對SOC1基因表達及開花的影響。為深入研究SOC1基因的表達調控提供一定的理論基礎。
　　主要試驗結果如下：
　　1.芥菜AGL24基因的克隆及生物信息學分析

3、r>　　以芥菜莖尖總RNA反轉錄cDNA第一鏈作為模板，擴增得到的AGL24基因的cDNA序列為666bp，預測編碼221個氨基酸殘基。通過ProtParam軟件分析表明AGL24蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu和Ser所占比例最高，相對分子質量為24.902kDa，理論等電點為7.67。
　　2.芥菜SOC1啟動子全長與AGL24蛋白相互作用檢測
　　篩選抑制重組酵母菌Y1H（pAbAi-SOC1）生長的環(huán)酯肽抗生素（A

4、ureobasidin A，簡稱AbA）的最低濃度，結果表明當AbA濃度為100ng/mL時，酵母重組菌株Y1H（pAbAi-SOC1）不能生長，由此說明抑制重組酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1）的AbA最低濃度為100ng/mL。然后將構建好的酵母表達載體pGADT7-AGL24轉化到Y1H（pAbAi-SOC1）酵母感受態(tài)細胞中，發(fā)現二倍體酵母Y1H（SOC1+AGL24）能在SD/-Leu/AbA100上正常生長，表明芥菜SO

5、C1啟動子能與AGL24蛋白相互作用。
　　同時，構建雙螢光素酶表達載體LUC-SOC1和SK-AGL24，通過冷熱刺激法轉化到農桿菌GV3101（pSoup）中。然后將這兩種菌液按1：9的比例混合共侵染6片左右真葉的本氏煙，60h后在GloMax?-Multi+多功能檢測儀上檢測螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶的活性，并計算螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶的比值。結果表明，試驗組的比值顯著高于陰性對照組的，說明SOC1啟動子與AGL

6、24蛋白在植物細胞內可以互作。
　　3.芥菜SOC1啟動子的截短體與AGL24蛋白相互作用檢測
　　為了進一步找出AGL24蛋白與SOC1啟動子結合的關鍵區(qū)域，本試驗篩選出抑制重組酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-1）、Y1H（pAbAi-SOC1-2）和Y1H（pAbAi-SOC1-3）生長的AbA最低濃度分別為100ng/mL、150ng/mL和100ng/mL。然后將酵母重組質粒pGADT7-AGL24分別轉化到Y

7、1H（pAbAi-SOC1-1）、Y1H（pAbAi-SOC1-2）和Y1H（pAbAi-SOC1-3）酵母感受態(tài)細胞中。結果發(fā)現：只有二倍體酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-2+AGL24）能在含有相應AbA背景濃度下的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA150上正常生長，而其他的均不能生長。
　　為了進一步鑒定芥菜SOC1啟動子截短體與AGL24在植物體內的互作情況，本試驗分別將SOC1啟動子的三個截短體與雙螢光素酶表達載體pGr

8、een II0800-LUC連接，得到重組質粒LUC-SOC1-1、LUC-SOC1-2和LUC-SOC1-3，通過冷熱刺激法分別轉化農桿菌感受態(tài)GV3101（pSoup）。然后分別將轉有啟動子片段的農桿菌菌液和轉有AGL24蛋白的農桿菌菌液按OD600比值1：9混合均勻。再將混勻的菌液分別侵染6片真葉的本氏煙，60h后在GloMax?-Multi+多功能檢測儀上檢測螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶的活性，并計算螢火蟲螢光素酶與海腎螢光

9、素酶的比值。結果表明：所有試驗組的比值均顯著高于陰性對照組的比值。說明三個截短體SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3均能與AGL24蛋白在植物細胞內相互作用。
　　4.芥菜SOC1的啟動子CArG-box突變體與AGL24相互作用檢測
　　為了更進一步分析AGL24蛋白是否特異性的結合到SOC1啟動子截短體上的CArG-box基序，本試驗提取實驗室已構建好的兩種SOC1啟動子突變體片段（CArG-box內A-T堿基互換突

10、變及CArG-box刪除突變體）與酵母表達載體連接的重組質粒，然后將其分別轉化酵母感受態(tài)菌株Y1H。篩選出抑制酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-1E）、Y1H（pAbAi-SOC1-2E）和Y1H（pAbAi-SOC1-3E）生長的AbA最低濃度分別為100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL，抑制酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-1D）、Y1H（pAbAi-SOC1-2D）和Y1H（pAbAi-SOC1-3D）生長的

11、AbA最低濃度分別均為100ng/mL。然后將酵母重組質粒pGADT7-AGL24分別轉化到Y1H（pAbAi-SOC1-1E）、Y1H（pAbAi-SOC1-2E）、Y1H（pAbAi-SOC1-3E）、Y1H（pAbAi-SOC1-1D）、Y1H（pAbAi-SOC1-2D）、Y1H（pAbAi-SOC1-3D）酵母感受態(tài)細胞中。結果發(fā)現：所有二倍體酵母菌株均不能在含有相應AbA背景濃度下的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA上正常生長。<

12、br>　　為了進一步確定芥菜SOC1啟動子突變體片段與AGL24在植物體內的互作情況，本試驗分別將SOC1啟動子的6個突變體片段與雙螢光素酶表達載體pGreen II0800-LUC連接，得到重組質粒LUC-SOC1-1E、LUC-SOC1-2E、LUC-SOC1-3E、LUC-SOC1-1D、LUC-SOC1-2D、LUC-SOC1-3D。并將重組質粒通過冷熱刺激法分別轉化重組農桿菌GV3101（pSoup），按OD600的比值1：9

13、將啟動子突變體片段與AGL24蛋白混合均勻。然后將混勻的菌液分別侵染6片真葉的本氏煙，60h后在GloMax?-Multi+多功能檢測儀上檢測螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶的活性，并計算螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶的比值。結果表明：所有試驗組的比值與陰性對照組的比值差異不顯著。說明SOC1截短體小片段CArG-box內A堿基與T堿基互換或者刪除CArG-box后，均不能與AGL24蛋白發(fā)生相互作用。以此推斷：SOC1與AGL24之間的