芥菜開花整合子AGL24與SVP、FLC、SOC1互作分析及作用位點的鑒定.pdf

1、芥菜開花時間的調控是一個復雜精細的過程，需要整合環(huán)境信號以及植物體內信號，在適宜的環(huán)境以及生理條件下才可以進行開花轉換，植物進而可以由營養(yǎng)生長轉向生殖生長。MADS-box轉錄因子在這個開花過程發(fā)揮的作用至關重要，并且在開花調控網(wǎng)絡中占據(jù)著許多關鍵性的位置。其中FLC和SVP作為開花抑制因子，而SOC1和AGL24能夠促進開花。AGL24、SOC1、SVP、FLC編碼的蛋白均屬于MIKC型蛋白，在調控開花網(wǎng)絡中它們是通過蛋白互作來行使其

2、功能的。而蛋白之間的相互作用對蛋白本身的功能以及它們所調控的生物進程也至關重要。芥菜中大多數(shù)的MADS結構域蛋白間的相互作用都保守，截止目前，有關SVP、SOC1、FLC的功能和作用機制已有較多研究，但是AGL24的分子機制鮮有報道。為了研究AGL24與這些同類蛋白在植物體內是否產生相互作用，并篩選出蛋白互作的關鍵氨基酸位點，本實驗利用了酵母雙雜交系統(tǒng)和雙分子熒光互補技術。研究AGL24蛋白與其他蛋白之間的相互作用，可以進一步的揭示分子

3、調控網(wǎng)絡中潛在的功能聯(lián)系，同時也為生物體內的生物進程在分子水平上作進一步的解釋。
　　主要試驗結果如下:
　　1.芥菜AGL24基因亞克隆及生物信息學分析
　　以芥菜莖尖總RNA反轉錄cDNA第一鏈為模板，擴增得到的AGL24基因的cDNA序列為666 bp，編碼221個氨基酸殘基，屬于MIKC型蛋白，與油菜的AGL24親緣關系最近，與毛白楊的相對最遠。AGL24蛋白主要呈現(xiàn)親水性，其二級結構預測分析表明芥菜AGL24

4、蛋白α螺旋占50％，且主要集中在K域，β折疊和卷曲螺旋分別占12％和38％。本試驗預測得到了AGL24蛋白的三維結構圖。
　　2.芥菜AGL24與SVP、FLC相互作用檢測
　　構建酵母誘餌表達載體pGADT7-AGL24以及AGL24去M域的重組質粒pGADT7-AGL24M，通過醋酸鋰轉化法將重組質粒轉化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉化子Y187(pGBKT7-AGL24)和Y187(pGBKT7-AGL24M)，經(jīng)過毒性及自

5、激活檢測，發(fā)現(xiàn)無自激活和毒性現(xiàn)象。將Y187(pGBKT7-AGL24)和Y187(pGBKT7-AGL24M)分別與本實驗室提供的 Y2HGold(pGBKT7-SVP)、 Y2HGold(pGBKT7-SVP)融合后，二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SVP)、 Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SVP)、Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGo

6、ld(pGBKT7-FLC)、Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-FLC)均不能在選擇型培養(yǎng)基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)平板上生長。
　　將AGL24及AGL24去M域截短體與BiFC中的C端載體（pSPYCE-35S）重組構建重組質粒YCEG和YCEGM，將SVP和FLC分別與BiFC的N端載體（pSPYNE-35S）重組構建重組質粒Y

7、NES和YNEF，通過冷熱刺激法轉化農桿菌GV3101。將含YCEG和YCEGM的農桿菌分別與含YNES和YNEF的農桿菌菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察，發(fā)現(xiàn)YCEG×YNES、YCEG×YNEF、 YCEGM×YNES、YCEGM×YNEF在本氏煙草表皮細胞上無黃色熒光發(fā)出。說明了開花信號整合子AGL24及AGL24去M域截短體與開花負調控因子SVP、FLC均沒有產生蛋

8、白相互作用。
　　3.芥菜AGL24與SOC1相互作用檢測
　　將Y187(pGADT7-AGL24)、Y187(pGADT7-AGL24M)分別與Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y2HGold(pGBKT7-SOC1M)融合后，二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1M)均能在選擇型培養(yǎng)

9、基SD/-Leu/-Trp/AbA(DD O/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)平板上長白色菌落、并能在QDO/X/A平板上生長呈現(xiàn)藍色菌斑，而二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1 M)經(jīng)多次鑒定表明不能在DDO/A、QDO、QDO/X/A上生長。
　　利用Thermo公司Y

10、eastβ-Galactosidase Assay Kit試劑盒測定雜交組合pGADT7-AGL24×pGBKT7-SOC1和pGADT7-AGL24M×pGBKT7-SOC1M的β-半乳糖苷酶活性來分析蛋白作用強度。發(fā)現(xiàn)全長蛋白AGL24與SOC1互作的平均酶活性(5.05 Miller Units)顯著低于截短體AGL24M與SOC1M之間的活性(8.24 Miller Units)，說明芥菜AGL24和SOC1蛋白的M域對蛋白互作

11、具有一定抑制作用。
　　將SOC1及SOC1去M域截短體與BiFC的N端載體(pSPYNE-35S)重組構建重組質粒YNEO和YNEOM。將含YCEG和YCEGM的農桿菌分別與含YNEO和YNEOM的農桿菌菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn)，共浸潤含YCEG和YNEO、YCEGM和YNEOM的本氏煙草表皮細胞發(fā)出黃色熒光，而共浸潤含YCEGM和YNEO、YCEG和Y

12、NEOM的本氏煙草表皮細胞不發(fā)光。綜上說明，開花信號整合子AGL24與SOC1及其兩蛋白均去掉M域的截短體存在相互作用，但兩蛋白中有且僅有其中一蛋白M域存在的情況下沒有蛋白互作。
　　4.芥菜AGL24突變體的構建及其與SOC1作用位點的篩選
　　在AGL24蛋白的K域預測了三個關鍵氨基酸殘基位點，并分別構建AGL24Q107L、AGL24R137L、AGL24E169L3個AGL24突變體，并構建 pGADT7-AGL24

13、Q107L、pGADT7-AGL24R137L，pGADT7-AGL24E169L突變體酵母表達載體。通過醋酸鋰轉化法將重組質粒轉化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉化子Y187的Y187（pGADT7-AGL24Q107L）、Y187(pGADT7-AGL24R137L)和Y187(pGADT7-AGL24E169L)。經(jīng)過毒性及自激活檢測，發(fā)現(xiàn)均無自激活和毒性現(xiàn)象。分別將這3個突變體的酵母轉化子與Y2HGold(pGBKT7-SOC1)融合，

14、發(fā)現(xiàn)二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24R137L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24E169L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)能在選擇型培養(yǎng)基QDO/X/A平板上長藍色菌落，而Y187(pGADT7-AGL24 Q107L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)不能生長。
　　酵母β-半乳糖苷酶活性分析表明:在與SOC1蛋白相互作用中，第137和169位點的AG

15、L24突變體（AGL24R137L和AGL24E169L）與與非突變體AGL24差異不顯著，它們的酶活分別為3.11，3.70和4.44，說明第137和169位點不是調節(jié)SOC1與AGL24之間作用強度的關鍵位點。
　　將AGL24三個突變體與BiFC中的C端載體(pSPYCE-35S)重組構建重組質粒YCEGQ107L、YCEGR137L、YCEGE169，與SOC1連BiFC的N端載體(pSPYNE-35S)構建重組質粒YNE

16、O，通過冷熱刺激法轉化農桿菌GV3101。將分別含YCEG Q107L、YCEGR137L、YCEGE169的農桿菌與含YNEO的農桿菌菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察，發(fā)現(xiàn)混合組合YCEGR137L×YNEO、YCEGE169L×YNEO有黃色熒光產生，混合組合YCEGQ107L×YNEO沒有熒光發(fā)出。綜上說明，開花信號整合子AGL24的第137位和169位氨基酸突變后對

17、蛋白相互作用沒有產生明顯的抑制作用，而第107位氨基酸突變后抑制了AGL24與SOC1蛋白的互作，說明第107位氨基酸時參與蛋白互作的關鍵氨基酸。
　　5.芥菜SOC1突變體與AGL24作用位點的篩選
　　通過醋酸鋰轉化法將本實驗室提供的SOC1突變體酵母表達質粒pGBKT7-SOC1 V77K、pGBKT7-SOC1P81K、pGBKT7-SOC1 K108V、pGBKT7-SOC1 R109L以及pGBKT7-SOC1

18、C137K轉化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K)，Y2HGold(pGBKT7-SOC1 P81K)，Y2HGold(pGBKT7-SOC1K108V), Y2HGold(pGBKT7-SOC1R109L)以及Y2HGold(pGBKT7-SOC1C137K)。經(jīng)過毒性及自激活檢測，發(fā)現(xiàn)均無自激活和毒性現(xiàn)象。分別將這5個突變體的酵母轉化子與Y187(pGADT7-AGL24)融合后的二倍體酵母均

19、能在選擇型培養(yǎng)基QDO/X/A平板上長藍色菌落。說明SOC1五個突變體蛋白能夠與AGL24蛋白相互作用，并激活報告基因H1S3、AUR1-C、ADE2、MEL1的轉錄表達。
　　酵母β-半乳糖苷酶活性表明:SOC1C137K突變體與AGL24蛋白的作用強度(酶活性為21.58)顯著高于非突變體SOC1（酶活性為4.44）。由此說明SOC1蛋白第137位氨基酸能夠調節(jié)SOC1/AGL24的聚合強度。另外，SOC1V77K×AGL24

20、、SOC1P81K×AGL24、SOC1K108V×AGL24、SOC1R109L×AGL24雜交組合彼此之間作用強度差異不顯著(酶活性分別為3.14、2.73、2.50和3.19)，但是均顯著低于SOC1×AGL24雜交組合（酶活性為4.44）.
　　通過冷熱刺激法將實驗室提供的SOC1突變體的BiFC重組質粒YNEOV77K、YNEOP81K、YNEOK108V、YNEOR109L以及YNEOC137K導入農桿菌GV3101中