芥菜AGL6、AGL15與SOC1、AGL24、SVP蛋白的互作研究.pdf

1、開花是植物生命活動過程中一個重要而復雜的過程，植物能感應(yīng)環(huán)境因子的改變，并結(jié)合自身遺傳因子做出相應(yīng)的發(fā)育調(diào)控，以便在合適的環(huán)境條件下做出花的發(fā)育，從而最大可能的獲取生存和繁殖后代的機會。這就使植物利用環(huán)境及遺傳因子調(diào)控植物營養(yǎng)生長到生殖生長（即開花）的轉(zhuǎn)變顯得尤為重要，晚開花可能讓植物生長得更加強壯，但不利于種子的產(chǎn)生；相對的，早開花不能保證植物有足夠的能量儲備來繁衍后代，由此可知開花時間的早晚關(guān)系到植物種子的形成，從而影響到植物種族的

2、延續(xù)。影響植物開花的因素很多，包含環(huán)境因子和遺傳因子，植物能通過多種遺傳途徑來對外界環(huán)境和植物內(nèi)環(huán)境做出相應(yīng)的反應(yīng)，這些遺傳途徑復雜而精確地調(diào)控植物開花。遺傳途徑中涉及到多種調(diào)控花發(fā)育的基因整合子，包括促進開花的基因LEAFY、FT、SOC1、CO以及開花抑制基因FLC、SVP、FLM等。這些基因編碼的蛋白大都屬于于MADS-Like蛋白，如SCO1、AGL24、SVP等，它們能直接或間接的調(diào)控開花。有關(guān)SOC1、AGL24、SVP等蛋

3、白的作用機制目前被廣泛研究，其調(diào)控機制以及蛋白間的相互作用已經(jīng)比較清楚。芥菜(Brassica juncea Coss)中開花整子SOC1、AGL24、SVP、FLC等的研究也有相應(yīng)報道，但是有關(guān)芥菜AGL6、AGL15與SOC1、AGL24、SVP之間的互作關(guān)系未見報道。為探究芥菜AGL6、AGL15在芥菜開花網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控關(guān)系，我們以芥菜QJ為材料，克隆芥菜AGL6、AGL15基因，并用酵母雙雜交技術(shù)和雙分子熒光互補技術(shù)研究芥菜AGL

4、6、AGL15蛋白與其他開花整合子蛋白間的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上進一步使用酵母單雜交和雙螢光素酶技術(shù)研究了AGL15啟動子與其他蛋白之間的作用關(guān)系。
　　主要試驗結(jié)果如下：
　　1.芥菜AGL6、AGL15的克隆及生物信息學分析
　　以芥菜莖尖總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，分別擴增得到芥菜AGL6基因和AGL15基因的cDNA序列：AGL6的cDNA序列為759bp，編碼252個氨基酸；AGL15的cDNA序列為795

5、bp，編碼264個氨基酸。以芥菜基因組DNA為模板擴增得到AGL6和AGL15的NDA序列為分別為1771bp和1616bp，cDNA和DNA對比發(fā)現(xiàn)，AGL15和AGL6都含8個外顯子和7個內(nèi)含子。二者均屬MIKC型蛋白，預(yù)測表明AGL6和AGL15蛋白大小為分別為28.85kDa和30.13kDa，理論等電點分別為9.15和9.02，兩者都屬于不穩(wěn)定蛋白，均與歐洲油菜親緣關(guān)系最近。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明AGL6和AGL15分別含有α螺旋約

6、40％與47%，主要集中在K域。
　　2．芥菜AGL15啟動子克隆與分析
　　使用芥菜基因組DNA為模板，利用染色體步移法克隆得到AGL15的啟動子890bp，分析表明AGL15啟動子與油菜親緣關(guān)系最近。對其進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該序列中含有TATA-box、CGTCA-motif、TGGTTT-ARE等多種啟動子相應(yīng)元件。
　　3.芥菜AGL6與SOC1、AGL24、SVP蛋白互作鑒定
　　將克隆得到的AGL6

7、基因構(gòu)建到酵母雙雜交質(zhì)粒pGADT7（以下簡稱 AD）和pGBKT7（以下簡稱BK）上得到AD重組質(zhì)粒pGADT7-AGL6和BK重組質(zhì)粒pGBKT7-AGL6，醋酸鋰（LiAC）轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化酵母細胞Y187、Y2HGold得到Y(jié)187[pGADT7-AGL6]和Y2HGold[pGBKT7-AGL6]酵母轉(zhuǎn)化子，使用對應(yīng)的缺陷培養(yǎng)基檢測確定酵母轉(zhuǎn)化子無毒無自激活。將含有BK重組質(zhì)粒（[pGBKT7-AGL6）的Y2HGold酵母轉(zhuǎn)化

8、子細胞分別與含有AD重組質(zhì)粒（pGADT7-SOC1、pGADT7-AGL24、pGADT7-SVP）的Y187酵母轉(zhuǎn)化子細胞進行融合，同時設(shè)立相應(yīng)的對照。結(jié)果顯示，除陰性對照以外的陽性對照及AGL6與SOC1、AGL24、SVP三個蛋白的酵母融合細胞均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA（以下簡稱QDO/X/A）固體培養(yǎng)基上長出藍色酵母菌落。
　　將AGL6分別與與BiFC載體中的N、C兩端載

9、體pGPTVⅡ.YFPN、pGPTVⅡ.YFPC相連接，構(gòu)建pGPTVⅡ.YFPN-AGL6和pGPTVⅡ.YFPC-AGL6載體，通過冷熱刺激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101?；旌喜⒆⑸?-6片本氏煙草葉片，48小時后置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)共注射組合GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SOC1]、GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-AG

10、L24]、GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]均發(fā)出黃色熒光，說明芥菜AGL6蛋白能分別SOC1、AGL24、SVP發(fā)生相互作用。
　　4．芥菜AGL6氨基酸敲除突變體與SOC1、AGL24、SVP蛋白作用檢測
　　預(yù)測芥菜AGL6蛋白互作位點，分別構(gòu)建三個氨基酸敲除突變體，AGL6D-NN（敲除第79和第80位的兩個天冬酰胺氨（NN））、AGL6D-RT（敲除第1

11、05位的精氨酸（R）和第106位蘇氨酸（T））、AGL6D-NNRT（同時敲除前面四提到的個氨基酸）。并構(gòu)建酵母BK的氨基酸敲除突變體重組質(zhì)粒pGBKT7-AGL6D-NN、pGBKT7-AGL6D-RT、pGBKT7-AGL6D-NNRT。將這三個含有突變體的Y2HGold酵母細胞分別與含SOC1、AGL24、SVP的Y187細胞進行融合，共9個組合，并設(shè)對照。結(jié)果表明，9個試驗組合中，只有Y2HGold[pGBKT7- AGL6D-

12、NNRT]×Y187[pGADT7-SVP]這1個組合的酵母融合二倍體不能在培養(yǎng)基QDO/X/A上產(chǎn)出菌落，其余8個試驗組合及所有的陽性對照均能夠在QDO/X/A產(chǎn)生藍色酵母菌落，陰性對照則都不能。說明氨基酸敲除突變體AGL6D-NNRT不能與SVP蛋白發(fā)生相互作用，AGL6D-NN、AGL6D-RT能與SVP發(fā)生相互作用，而AGL6D-NN、AGL6D-RT、AGL6D-NNRT均能與SOC1和AGL24發(fā)生相互作用。
　　構(gòu)建

13、AGL6突變體 N端突變體質(zhì)粒pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NN、pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-RT、pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NNRT。分別將含AGL6突變體的農(nóng)桿菌與GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]農(nóng)桿菌混合注射浸潤煙草葉片，48小時后觀察發(fā)現(xiàn)GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NN]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]和GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-

14、RT]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]組合有黃色熒光發(fā)出。組合GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NNRT]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]無熒光發(fā)出，結(jié)果說明AGL6氨基酸敲除突變體AGL6D-NN、AGL6D-RT與蛋白SVP有相互作用，而AGL6氨基酸敲除突變體AGL6D-NNRT與SVP蛋白無相互作用。說明可能第79、80、105和106位上的氨基酸共同調(diào)控AGL6與SVP的相互作用

15、。
　　5.芥菜AGL15與SOC1、AGL24、SVP、AGL6蛋白互作鑒定
　　將AGL15構(gòu)建到分別構(gòu)建到AD和BK質(zhì)粒上得到酵母重組質(zhì)粒pGADT7-AGL15和pGBKT7-AGL15。將含有AGL15的Y2HGold酵母細胞分別與待鑒定的含有SOC1、AGL24、SVP及AGL6的Y187酵母細胞進行融合，總共四個試驗組合，平行設(shè)立對照試驗。試驗表明，含有AGL15的Y2HGold酵母與含有AGL24的Y187酵

16、母組合Y2HGold[pGBKT7-AGL15]×Y187[pGADT7-AGL24]的二倍體酵母細胞能夠在QDO/X/A平板上長出藍色酵母菌，剩下的三個試驗組合均不能生長，對照組試驗結(jié)果同上。
　　構(gòu)建AGL15到BiFC表達載體質(zhì)粒共浸潤本氏煙草葉片表皮細胞，48小時后置于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示只有共浸潤組合為GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL15]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-AGL24]的葉表皮細胞

17、觀察到了黃色熒光，其余組合無黃色熒光。說明芥菜中AGL15蛋白能與AGL24發(fā)生互作，但不能與SOC1、SVP發(fā)生互作。
　　6.芥菜AGL15氨基酸敲除突變體與AGL24互作檢測
　　在線預(yù)測 AGL15的蛋白作用位點，構(gòu)建三個敲除氨基酸的突變體，分別為：AGL15D-EK(敲除第107（E）位谷氨酸和第10位賴氨酸(K))、AGL15D-R(敲除第170位精氨酸(R))、AGL15D-EKR(同時敲除以上三個氨基酸)。構(gòu)

18、建三個AGL15氨基酸敲除突變體的BK酵母表達質(zhì)粒pGBKT7-AGL15D-EK、pGBKT7-AGL15 D-R、pGBKT7-AGL15 D-EKR。然后分別用含有AGL24的酵母細胞Y187分別與三個突變體轉(zhuǎn)化子Y2HGold進行酵母的融合，同時設(shè)立對照，結(jié)果表明，陰性對照和陽性對照結(jié)果同上，試驗組合中Y2HGold[pGBKT7-AGL15D-EK]×Y187[pGADT7-AGL24]酵母二倍體細胞能在QDO/X/A生長并呈

19、現(xiàn)藍色，而二倍體酵母Y2HGold[pGBKT7-AGL15D-R]×Y187[pGADT7-AGL24]及Y2HGold[pGBKT7-AGL15D-EKR]×Y187[pGADT7-AGL24]在培養(yǎng)基QDO/X/A上無酵母長出。
　　同時構(gòu)建對應(yīng)的BiFC表達載體混合注射煙草表皮細胞，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)只有共侵染GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL15-A D-EK]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-AGL2

20、4]的有黃色熒光產(chǎn)生，其余兩組均無熒光產(chǎn)生。由此可知芥菜AGL15氨基酸敲除突變體AGL15 D-EK能和AGL24蛋白發(fā)生相互作用，但是突變體AGL15 D-R和AGL15D-EKR均不能與蛋白AGL24發(fā)生相互作用，說明第170位氨基酸時調(diào)控AGL15與SVP蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點。
　　7．芥菜AGL15啟動子與蛋白SOC1、AGL24、AGL15、AGL6的互作鑒定
　　構(gòu)建芥菜AGL15啟動子酵母單雜重組質(zhì)粒

21、pAbAi-AGL15Q，將其轉(zhuǎn)化到Y(jié)1HGold酵母得到Y(jié)1HGold(pAbAi-AGL15Q)酵母轉(zhuǎn)化子，并進行抗AbA濃度篩選。同時將構(gòu)建好AD酵母重組質(zhì)粒pGADT7-SOC1、pGADT7-AGL24、pGADT7-AGL15、pGADT7-AGL6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化（LiAC）到含有AGL15啟動子的酵母Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]中得到Y(jié)1HGold[pAbAi-AGL15Q]+SOC1、Y1HGold[pAbA

22、i-AGL15Q]+AGL24、Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]+AGL15都能在AbA濃度板上生長，但是Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]+AGL6不能在AbA+150濃度板上生長。
　　同時將AGL15啟動子構(gòu)建到到雙熒光素酶法載體pGreenⅡ0800-LUC上得到pGreenⅡ0800-LUC-AGL15Q。分別將啟動子載體與其他四蛋白載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中得到GV3101[pGreenⅡ0800

23、-LUC-AGL15Q]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-SOC1]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-AGL24]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-AGL15]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-AGL6]。將GV3101[pGreenⅡ0800-LUC-AGL15Q]農(nóng)桿菌分別與其他四個蛋白載體的農(nóng)桿菌進行混合并注射浸入本氏煙草葉片，48小時后取材置于酶標儀下測定數(shù)值并計算。結(jié)果顯示，AGL15啟動子與S