基于水產(chǎn)品下腳料ACEIP生物法制備及其分離純化、性質(zhì)的研究.pdf

1、本論文以水產(chǎn)蛋白下腳料為原料，進(jìn)行了可控酶解法、復(fù)合酶解法、微生物發(fā)酵法等生物法制備ACEIP(AngiotensinⅠ Converting Enzyme Inhibitory Peptide)的工藝及條件優(yōu)化、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)以及肽的分離純化、結(jié)構(gòu)測定和功能性質(zhì)的系統(tǒng)研究。
　　 首先，針對海洋魚類蛋白及其加工下腳料、淡水魚類蛋白及貽貝類等水產(chǎn)蛋白進(jìn)行適合于ACE抑制肽生產(chǎn)制備的原料篩選，分析了15種水產(chǎn)蛋白的組成成分，以血管緊張

2、素轉(zhuǎn)換酶半抑制濃度(ACEIC50)為評價(jià)指標(biāo)，比較了酸性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解效果，篩選出帶魚脊骨作為進(jìn)一步研究的材料。
　　 對帶魚脊骨可控酶解法制備ACE抑制肽的工藝進(jìn)行研究。分析比較了酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶及彈性蛋白酶對帶魚脊骨的酶解效果，以ACEIC50和抗氧化活性(還原力，OD700)為ACEIP的主要評價(jià)指標(biāo)，從中篩選出酸性蛋白酶為最適酶，并對酸性蛋白酶

3、的酶解條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化分析，得出了最佳的可控酶解條件為：酶解pH2.67；酶解溫度45℃；時(shí)間7h；料水比為1：4.38(m/v，g/mL)；加酶量為1/150(g/g protein)。在此條件下，酶解液的ACEIC50為1.05mg/mL，抗氧化活性(還原力OD700)為0.638。
　　 在單酶可控酶解的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了復(fù)合酶解對帶魚脊骨的酶解效果，以ACEIC50為ACE抑制肽的主要評價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得

4、出復(fù)合酶解的最適酶組合及酶解條件為：以彈性蛋白酶在溫度37℃，pH7.5，料水比1：4.5(m/v，g/mL)，加酶量1/100．g/g protein的條件下水解3小時(shí)后，再以胃蛋白酶在相同溫度，pH2.0，加酶量1/300g/g protein的條件下水解2小時(shí)，在此條件下，酶解液的ACEIC50達(dá)到0.88mg/mL。
　　 可控酶解法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)會(huì)受到酶品種及成本的限制。本論文首次深入研究了微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化帶魚脊骨制

5、備ACEIP的菌種篩選、培養(yǎng)基組成，并利用響應(yīng)面方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化研究，得到用于轉(zhuǎn)化的最佳菌種為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformisEL314CF10)；最適宜的培養(yǎng)條件：蔗糖含量4.42％；帶魚脊骨含量4.39g/25mL；K2HPO40.1％；MgSO40.01％；pH7.0(滅菌后)；溫度37℃；搖床轉(zhuǎn)速200rpm；裝液量25mL/250mL搖瓶；種齡18h；接種量4％；培養(yǎng)時(shí)間28h。在此條件下，發(fā)酵液A

6、CEIC50值可達(dá)0.78mg/mL；還原力(OD700)達(dá)0.812，接近2mg/mL的抗壞血酸的抗氧化活性。
　　 為了將研究成果應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，給生產(chǎn)實(shí)際提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本論文還利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行了微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，培養(yǎng)條件為：溫度37℃，攪拌速率200rpm，通氣量1vvm，不控制發(fā)酵pH。通過數(shù)學(xué)分析及計(jì)算，得到了底物消耗和產(chǎn)物生成的動(dòng)力學(xué)模型如下：
　　 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型：X=X0eμmX1/1—X0

7、/Xm(1—eμmX1)
　　 ACE抑制活性(1/ACEIC50)增長動(dòng)力學(xué)模型：
　　 X=5.3α[e6.96X1/1—0.68(1—e6.96X1)—1]+1.14βln(1—0.68(1—e6.96X1))
　　 蔗糖消耗動(dòng)力學(xué)模型：
　　 X=4—5.3γ[e6.96X1/1—0.68(1—e6.96X1)—1]+1.14δln(1—0.68(1—e6.96X1))
　　 對模型參數(shù)進(jìn)

8、行F檢驗(yàn)，顯著性均很高(P＜0.01)，即模型在99％的概率水平上是非常顯著的，模型計(jì)算值與試驗(yàn)值擬合良好，說明模型具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 采用現(xiàn)代分離技術(shù)，包括超濾法，層析法及制備型液相色譜對試驗(yàn)得到的多肽混合物進(jìn)行了分級分離純化。帶魚脊骨生物活性肽的活性成分集中在分子量小于5000Da的組分。對這部分多肽混合物進(jìn)行了凝膠色譜分離，得到了14個(gè)峰，以酩氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定了分離組分蜂的分子量，發(fā)現(xiàn)，ACE抑制肽集中在分子

9、量較小(主要1000Da以下)的組分；而抗氧化活性集中在分子量稍大(500—3000Da)的多肽組分。
　　 對ACE抑制活性最高的峰進(jìn)行了進(jìn)一步純化，最后得到了純度和活性均很高的單組分ACE抑制肽。利用液質(zhì)聯(lián)用法測定了ACE抑制肽的表觀分子量為317.25，進(jìn)而利用氨基酸N—端測序技術(shù)測定了得到的該肽氨基酸一級結(jié)構(gòu)為LW，其ACEIC50為5.6μM。
　　 在對帶魚脊骨ACE抑制肽進(jìn)行了分離純化和性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，為

10、了進(jìn)一步驗(yàn)證帶魚脊骨ACE抑制肽的體內(nèi)作用效果和功能性質(zhì)，對得到的帶魚脊骨ACE抑制肽進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)研究。利用超濾法得到分子量小于1000Da的ACE抑制肽，以此部分活性肽對原發(fā)性高血壓大白鼠(SHR，Spontaneously Hypertensive Rat)進(jìn)行一次性灌胃和長期灌胃試驗(yàn)，和小白鼠游泳試驗(yàn)。結(jié)果顯示，帶魚脊骨ACE抑制肽對原發(fā)性高血壓大白鼠(SHR)具有明顯的降血壓作用，對SHR心率沒有不良影響。低劑量組(10.