先天缺牙致病基因的篩查及遺傳學研究.pdf

1、牙齒發(fā)育是上皮和間充質之間相互作用的復雜過程,許多轉錄因子和信號分子參與其中。牙齒發(fā)育不良(hypoplasiaofteeth)是人類最常見的顱面先天畸形,包括牙齒數(shù)目、形狀和結構異常。牙齒數(shù)目異常,即先天缺牙(congenitaltoothagenesis)是人類牙列中最常見的發(fā)育異常。在人群中,單顆牙齒先天缺失比例可高達20％。在排除第三磨牙缺失比例的情況下,恒牙缺失的發(fā)病率為1.6%-9.6%,乳牙先天缺失的發(fā)病率較低。除第三磨牙

2、外,第二前磨牙和側切牙最容易受累。按缺牙數(shù)一般分為少數(shù)牙缺失(hypodontia)、多數(shù)牙缺失(oligodontia)以及全口無牙(anodontia)。其中,少數(shù)牙缺失指缺失牙齒數(shù)少于6顆;多數(shù)牙缺失指牙齒先天缺失6顆及以上(不包括第三磨牙)。牙齒先天缺失可由環(huán)境因素或遺傳因素造成。臨床上可見到散發(fā)病例和家族遺傳病例,后者可以是常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或X染色體連鎖遺傳。先天缺牙不僅影響患者的咀嚼功能,而且影響其發(fā)音、容

3、貌及心理健康。按照是否伴有其他組織器官改變,先天缺牙可分為綜合征型和非綜合征型。外胚葉發(fā)育不良綜合征(ectodermaldysplasiasyndrome,EDs)是臨床上最常見的綜合征型先天缺牙。患兒除了先天缺牙,還伴發(fā)其他外胚層來源組織的發(fā)育障礙,如指甲、皮膚、毛發(fā)及汗腺。臨床以排汗障礙嚴重程度,又分為少汗型和無汗型兩種。
　　大量研究表明,與先天缺牙相關的基因有200余種,一般認為PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因

4、與非綜合征型先天缺牙密切相關,而最常見的綜合征型先天缺牙——外胚葉發(fā)育不良綜合征,其致病基因主要為EDA、EDAR及EDARADD。
　　本研究通過臨床檢查收集先天缺牙家系,對相關候選基因進行檢測并初步預測其功能改變,探討先天缺牙患者的基因突變位點及發(fā)病機制。
　　第一部分先天缺牙家系病例調查和樣本收集
　　1.材料及方法:本研究收集有先天缺牙臨床表現(xiàn)的病例,以先證者恒牙或乳牙先天缺失數(shù)目大于或等于6顆為基本納入標準,

5、收集前來我科就診的無血緣關系的7個家系。以是否伴有毛發(fā)及汗腺發(fā)育異常分為綜合征型先天缺牙(少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良)及非綜合征型先天缺牙,繪制先天缺牙家庭家系圖譜,對家庭成員進行相關臨床檢查及病史采集,分別分析兩種類型先天缺牙的遺傳方式,了解各自發(fā)病特點。采集相關實驗室所需樣本,提取后妥善保存。
　　2.結果:7個家系均為中國漢族人群,包括5例非綜合征型先天缺牙家系及2例少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良家系。各家庭成員均無其他先天發(fā)育

6、缺陷。家族中無近親婚史,亦無流產史。非綜合征型先天缺牙受累牙位主要集中在第二前磨牙及側切牙,對于同側頜,同一牙位,側切牙缺失數(shù)目上頜多于下頜,而切牙缺失數(shù)目下頜多于上頜。對于第二前磨牙上下頜基本無差異。除一個家系中先證者乳恒牙全部缺失外,少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良患兒先天缺牙程度明顯較重。7個家系中,除家系5及家系7外,結合相關疾病常見遺傳方式,我們認為家系1是常染色體顯性遺傳,家系2及家系6為X染色體顯性遺傳,家系4為X染色體顯性遺傳

7、或常染色體顯性遺傳。采集提取到了合格的DNA及cDNA樣本。
　　3.結論:先天缺牙遺傳病的遺傳特征可能是X染色體顯性遺傳或常染色體顯性遺傳。非綜合征型先天缺牙受累牙位主要集中在第二前磨牙及側切牙,就同一牙位而言側切牙缺失易發(fā)生在上頜,而切牙缺失易發(fā)生在下頜。
　　第二部分先天缺牙家系候選基因篩查及突變位點確定
　　1.材料及方法:查閱文獻結合DNAStar及Premier5.0軟件設計合成候選基因(PAX9、MSX1

8、、AXIN2、EDA、EDAR、EDARADD)引物。對非綜合征型先天缺牙家系PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因外顯子進行PCR擴增,PCR產物純化后測序。對于少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良的家系先檢測EDA基因,后續(xù)檢測EDAR及EDARADD基因。所有測序結果參照GENEBANK相關序列進行比對,將測得的突變位點同正常人群樣本比對,并查詢數(shù)據(jù)庫排除常見SNP位點,最終結合相關數(shù)據(jù)庫及文獻查新。
　　2.結果:本研究在2個非

9、綜合征型先天缺牙家系中分別發(fā)現(xiàn)2個新的EDA基因錯義突變:p.G257R,p.V309L;發(fā)現(xiàn)一個新的MSX1內含子剪切位點突變:IVS1-2A>T;發(fā)現(xiàn)一個已報道PAX9基因錯義突變:p.R47W。在一個無汗型外胚葉發(fā)育不良家系中發(fā)現(xiàn)2個新的EDA基因錯義突變:p.L296V,p.E308D。另一個少汗型外胚葉發(fā)育不良家系經基因測序驗證為散發(fā)病例,患兒存在一個新的EDA基因錯義突變:p.E308K。這5個EDA基因突變位點均位于TNF

10、區(qū)域。
　　3.結論:上述3個基因新突變位點的發(fā)現(xiàn)證明非綜合征型先天缺牙可能與致病基因PAX9、MSX1及EDA有關;并進一步驗證了EDA為綜合征型先天缺牙的致病基因,同時擴大了以上基因的突變譜。
　　第三部分先天缺牙家系突變基因及其突變位點結構功能預測
　　1.材料及方法:通過剪切位點預測網站比較突變前后MSX1內含子剪切位點的變化。另外,對本研究發(fā)現(xiàn)的5個EDA基因新突變進行保守性分析,模擬其蛋白產物三聚體三維結構

11、,并與野生型EDA基因相對比,分析蛋白表面構象及分子表面能量電場差異等,探討基因型與表現(xiàn)型的聯(lián)系。
　　2.結果:剪切位點預測顯示IVS1-2A>T突變對MSX1基因內含子剪切產生重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)的5個EDA基因突變位點,均有高度保守性。突變EDA基因的蛋白產物,因氨基酸發(fā)生改變(堿基突變后翻譯得到氨基酸支鏈及電荷能量不同),使EDA基因蛋白產物三聚體表面構象及分子表面能量電場都發(fā)生了較大改變。
　　3.結論:EDA,M