幾丁質(zhì)酶和群體感應(yīng)信號(hào)在Serratia plymuthica生防活性中的作用.pdf

1、Serratia plymuthica HRO-C48分離自油菜根際,是一株產(chǎn)吲哚乙酸的植物根際促生細(xì)菌,主要通過(guò)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和抗生素硝吡咯菌素等抗真菌因子抑制植物病原真菌。本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)座子插入突變的策略,通過(guò)突變分析,在離體和溫室條件下,研究了幾丁質(zhì)酶和群體感應(yīng)信號(hào)在菌株HRO-C48生物防治中的作用；以HRO-C48基因組DNA為模板,克隆并在大腸桿菌E.coli中異源表達(dá)了第二個(gè)群體感應(yīng)(Quornm sensing,QS)

2、系統(tǒng)luxI/R同源物基因sprR/I。主要研究結(jié)果如下： 1.運(yùn)用miniTn5轉(zhuǎn)座子插入隨機(jī)突變的方法構(gòu)建突變體庫(kù),通過(guò)幾丁質(zhì)酶固體培養(yǎng)基檢測(cè),篩選出HRO-C48的幾丁質(zhì)酶缺失的突變株(chit)：通過(guò)報(bào)告菌株Chromobacterium violaceum CV026平板劃線檢測(cè),篩選出HRO-C48的信號(hào)分子缺失的突變株(AHL-4);通過(guò)克隆信號(hào)分子合成酶基因splIR(GenBank accession no.A

3、Y841161)和引入重組質(zhì)粒構(gòu)建了互補(bǔ)菌株(AHL-4/splIR),并經(jīng)酶切反應(yīng)、PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。 2.采用平板對(duì)峙法測(cè)定了生防菌S. plymuthica HRO-C48及其衍生菌株對(duì)常見(jiàn)植物病原菌的抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明,HRO-C48對(duì)灰葡萄孢Botrytis cinema和瓜果腐霉Pythium aphanidermatum的菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,相比之下,突變株AHL-4的抑菌作用減弱,而AHL-4/sp

4、lIR的抑菌活性又回到野生菌株的水平；chit與HRO-C48的抑菌作用無(wú)明顯差別。說(shuō)明QS信號(hào)調(diào)控HRO-C48的抑菌活性,且在HRO-C48的拮抗作用過(guò)程中,抗生素處于重要地位。 3.用細(xì)菌懸浮液對(duì)番茄和菜豆進(jìn)行浸種和灌根處理,測(cè)定生防菌及其衍生菌株誘導(dǎo)番茄和菜豆對(duì)灰霉病的抗病性。結(jié)果表明,無(wú)論是番茄還是菜豆,與野生菌HRO-C48相比,突變株AHL-4的誘導(dǎo)抗病性水平明顯降低,說(shuō)明QS信號(hào)正向控制寄主植物對(duì)灰霉病的誘導(dǎo)系統(tǒng)

5、抗性；而通過(guò)比較野生菌HRO-C48與突變株chit的誘導(dǎo)抗性效果,我們可以看出,幾丁質(zhì)酶作為HRO-C48的誘導(dǎo)因子在番茄中比在菜豆中表現(xiàn)明顯。 4.將細(xì)菌懸浮液對(duì)黃瓜進(jìn)行浸種和灌根處理,在溫室中測(cè)定對(duì)黃瓜苗期猝倒病的直接防治作用。病害調(diào)查結(jié)果表明,與自來(lái)水處理作對(duì)照相比,HRO-C48對(duì)黃瓜苗期猝倒病的防治效果達(dá)50-24％,QS信號(hào)突變株AHL-4的防治效果明顯降低,僅為27-64％,表明QS信號(hào)影響HRO-C48對(duì)瓜果腐

6、霉引起的黃瓜苗期猝倒病的防治效果；而幾丁質(zhì)酶突變株chit的防治效果為37.30％,介于菌株AHL-4與HRO-C48之間,說(shuō)明在HRO-C48對(duì)黃瓜苗期猝倒病的防治過(guò)程中,除了直接的抑菌作用外,可能還包括幾丁質(zhì)酶對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病性作用。 5.用野生菌株HRO-C48和不同突變株預(yù)先對(duì)番茄進(jìn)行浸種和灌根處理,隨后在番茄葉片挑戰(zhàn)接種灰霉菌,均能不同程度誘導(dǎo)番茄葉片內(nèi)寄主防御酶PAL、POD和PPO活性的增強(qiáng)及酚類物質(zhì)的積累。試驗(yàn)結(jié)

7、果表明,無(wú)論是防御酶活性,還是酚類物質(zhì)含量,用生防菌處理后再接種灰霉菌的番茄比單獨(dú)接種生防菌的番茄要高；而在各處理中,HRO-C4S明顯高于AHL-4,AHL-4/splIR恢復(fù)到野生菌水平,幾丁質(zhì)酶缺失突變株chit與HRO-C48相近,但也有差別,而自來(lái)水作對(duì)照處理的番茄活性最低。說(shuō)明挑戰(zhàn)接種灰霉菌有效激發(fā)了番茄體內(nèi)寄主防御酶的活性及總酚含量的積累,并與番茄對(duì)灰霉病的抗性增加趨勢(shì)存在顯著的正相關(guān)。 6.根據(jù)親緣關(guān)系相近的細(xì)菌

8、屬的LuxIR同源物序列比對(duì),設(shè)計(jì)保守性引物,以HRO-C48的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將回收的PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化到E.coil JM 109感受態(tài)細(xì)胞,獲得陽(yáng)性克隆,測(cè)序并在大腸桿菌中成功異源表達(dá)。利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行相似性序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果表明,S.plymuthica HRO-C48的sprRI基因與S. proteomaculans 568的luxRI基因、S.marcescens st