兩種骨髓間充質(zhì)干細胞對K562細胞生長調(diào)控的不同作用及機制.pdf

1、目的:與實體腫瘤相同，血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展的始動因素同樣是原癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活。但與實體腫瘤不同的是，血液腫瘤的生長增殖發(fā)生在一個精密而復雜的調(diào)控系統(tǒng)——造血微環(huán)境中。正常情況下，造血微環(huán)境中具有調(diào)控活性的基質(zhì)細胞通過合成和釋放造血因子和造血抑制因子來調(diào)控血細胞的生長，并維持血細胞在不同階段的正常形態(tài)。
　　作為一種起源于多功能造血干細胞的惡性克隆性疾病，慢性髓細胞白血病(chronic myelocytic leu

2、kemia CML)通常以外周血白細胞的異常增高，CML白血病細胞以中性中、晚幼粒及成熟粒細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞增多等為特征。相較于正常骨髓象和血象，CML的這一系列變化恰恰說明CML腫瘤細胞的生殖和分化打破了正常的造血調(diào)控的平衡，提示我們CML患者的骨髓造血微環(huán)境發(fā)生了異常變化。
　　為了研究骨髓造血微環(huán)境對CML腫瘤細胞的增殖是促進還是抑制，我們選取骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesench

3、ymal stem cell，BMMSCs)在體外模擬造血微環(huán)境中的骨髓基質(zhì)細胞，因為BMMSCs是造血微環(huán)境中基質(zhì)細胞的干細胞，可以分化成各類基質(zhì)細胞，并能分泌多種細胞因子參與骨髓造血的調(diào)控。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體通路中的TAB1、TBK1、MAPK11、CXCL10等基因在CML慢性期和急變期白血病細胞中的表達量存在著顯著差異，而這種差異是否在CML白血病細胞的產(chǎn)生和增殖過程中起著重要的調(diào)控作用尚不清楚。
　　

4、為了很好的探索這一問題，我們選用健康人來源的人骨髓間充質(zhì)干細胞株(Human Mesenchymal Stem Cell-bone marrow,HMSC-hm)和CML慢性期初治患者來源的骨髓間充質(zhì)干細胞在體外分別模擬健康人的骨髓微環(huán)境和CML患者的骨髓微環(huán)境，以K562細胞株模擬CML白血病細胞，采用K562細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)的方式，構建出一個類似人體骨髓造血微環(huán)境對CML白血病細胞調(diào)控的模型，通過繪制K562細胞生長曲線

5、，檢測共培養(yǎng)細胞的上清液中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α等細胞因子，比較不同方法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞TAB1、TBK1和NF-κB基因及蛋白產(chǎn)物表達情況的不同，比較不同方法培養(yǎng)的K562細胞中β-catenin基因及蛋白產(chǎn)物表達情況的不同，對骨髓間充質(zhì)干細胞對K562細胞生長調(diào)控的不同影響以及Toll樣受體通路在該調(diào)控過程中可能的作用機制進行了初步探討。
　　方法:
　　1.第一部分、比較慢性髓細胞白血病患者的

6、骨髓間充質(zhì)干細胞與人骨髓間充質(zhì)干細胞株對K562細胞增殖的不同作用
　　(1)分組，以K562細胞與慢性髓細胞白血病患者的骨髓間充質(zhì)干細胞(CML-BMMSCs)共培養(yǎng)組為實驗組一，K562細胞與健康人骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)組(HMSC-hm)為實驗組二，以K562單獨培養(yǎng)組為對照組。
　　(2)CCK8法繪制K562細胞生長曲線。
　　(3)流式細胞術檢測K562細胞凋亡。
　　2.第二部分、兩種BMMSCs的

7、NF-κB、TAB1和TBK1基因和蛋白產(chǎn)物以及受其調(diào)控的細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α表達水平的比較
　　(1)分組，以CML-BMMSCs細胞和K562細胞共培養(yǎng)組為實驗組一，以HMSC-hm細胞和K562細胞共培養(yǎng)組為實驗組二，以CML-BMMSCs細胞單獨培養(yǎng)組為對照組一，以HMSC-hm細胞單獨培養(yǎng)組為對照組二。
　　(2)RT-PCR檢測TAB1基因、NF-κB基因和TBK1基因在四組骨髓間充

8、質(zhì)干細胞(BMMSCs)中的表達情況。
　　(3)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測TAB1、NF-κB和TBK1蛋白產(chǎn)物在四組BMMSCs中的表達情況。
　　(4)以酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測和比較各組IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α細胞因子分泌水平。
　　3.第三部分、兩種骨髓間充質(zhì)干細胞影響K562細胞株經(jīng)典Wnt/β-catenin信號途徑活性的初步研究
　　(1)分組，以K562細胞與CM

9、L-BMMSCs細胞共培養(yǎng)組為實驗組一，以K562細胞與HMSC-hm細胞共培養(yǎng)組為實驗組二，以K562單獨培養(yǎng)組為對照組一，以重組人干擾素α2b處理72小時的K562細胞為對照組。
　　(2)RT-PCR檢測β-catenin基因在四組K562細胞中的表達情況。
　　(3)Western blot檢測β-catenin蛋白在四組K562細胞中的表達情況。
　　結果:
　　1.三組K562細胞生長曲線表明，0h到

10、48h之間三組K562細胞生長均較為緩慢，48h至72h，三組K562細胞增殖開始加速，但實驗組二K562細胞生長較其它兩組相對緩慢，差異存在顯著性(P＜0.05)，表明其增殖受到一定程度的抑制，而實驗組一與對照組的K562增殖速度不存在顯著差異(P＞0.05)。
　　2.流式細胞儀檢測培養(yǎng)72h后的三組K562細胞，其早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞的結果如下:實驗組一1.52±0.10，實驗組二13.33±7.68，對照組2.46±

11、0.88。實驗組二最高，與實驗組一及對照組存在十分顯著的差異(P＜0.01)。實驗組一和對照組不存在顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.四組骨髓間充質(zhì)干細胞NF-κB、TAB1和TBK1的RT-PCR檢測結果
　　(1) NF-κB/β-actin mRNA表達值為:實驗組一0.0402±0.0024，實驗組二0.0196±0.0025，對照組一0.0214±0.0028，對照組二0.0188±0.0036。實驗組一最高，

12、與實驗組二、對照組一及對照組二相比均存在顯著的差異(P＜0.05);實驗組二與對照組一及對照組二相比均不存在顯著的差異(P＞0.05);對照組一與對照組二相比差異性不顯著(P＞0.05)。
　　(2) TAB1/β-actin mRNA表達值為:實驗組一0.0319±0.0086，實驗組二0.0224±0.0051，對照組一0.0252±0.0030，對照組二0.0134±0.0046。其中，其中，實驗組一、實驗組二及對照組一兩兩

13、比較差異均不顯著(P＞0.05)，但三組與對照組二兩兩比較均存在顯著的差異(P＜0.05)。
　　(3) TBK1/β-actin mRNA表達值為:實驗組一0.0406±0.0080，實驗組二0.0584±0.0094，對照組一0.0504±0.0091，對照組二0.0614±0.0130。其中，對照組二最高，與實驗組一相比較差異性顯著(P＜0.05)，但與實驗組二及對照組一相比較均無顯著差異(P＞0.05);實驗組一、實驗組二

14、和對照組二兩兩比較均不存在顯著差異(P＞0.05)。
　　4.四組骨髓間充質(zhì)干細胞NF-κB、TAB1和TBK1蛋白產(chǎn)物Western blot檢測結果
　　(1)四組骨髓間充質(zhì)干細胞均能表達NF-κB蛋白，但對照組二與其它三組相比較已經(jīng)明顯收窄。Quantity One圖像分析軟件分析NF-κB蛋白條帶的光密度值結果及其柱狀圖表明，NF-κB蛋白濃度由高到低依次為實驗組一、對照組一、實驗組二和對照組二。
　　(2)四

15、組骨髓間充質(zhì)干細胞均能表達TAB1蛋白，但對照組二的蛋白條帶較其它三組條帶明顯收窄。使用Quantity One圖像分析軟件分析TAB1蛋白條帶的光密度值，可知TAB1蛋白濃度由高到低依次為實驗組一、、對照組一、實驗組二和對照組二。
　　(3)四組骨髓間充質(zhì)干細胞均能表達TBK1蛋白，其中實驗組一和對照組一的蛋白條帶較窄，實驗組二和對照組二較寬。使用Quantity One圖像分析軟件分析TAB1蛋白條帶的光密度值，可以得出TBK

16、1蛋白濃度由高到低依次為實驗組二、對照組二、對照組一和實驗組一。
　　5.四組細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α的ELISA法檢測結果
　　(1) IL-6 OD450值，實驗組一23.75±1.32，實驗組二25.21±0.30，對照組一16.47±0.94，對照組二14.62±0.92。實驗組二最高，與兩個對照組相比均存在顯著差異(P＜0.05)，但與實驗組一不存在顯著差異(P＞0.05)。實驗組一與

17、兩個對照組同樣存在顯著差異(P＜0.05)。兩個對照組相比也存在顯著差異(P＜0.05)。
　　(2) IL-8 OD450值，實驗組一1269.28±4.12，實驗組二6022.64±134.71，對照組一66.26±11.56，對照組二127.26±4.49。實驗組二最高，與其它三組均存在顯著的差異(P＜0.01)。實驗組一與兩個對照組均存在十分顯著的差異（P＜0.01）。CML-BMMSCs兩個對照組之間則無顯著差異（P＞0

18、.05）。
　　(3) TNF-α OD450值，實驗組一32.17±0.83，實驗組二36.33±7.03，對照組一50.79±4.01，對照組二44.17±3.09。對照組一最高，與對照組二無顯著性差異（P＞0.05），但與兩個實驗組相比存在顯著的差異(P＜0.05)。對照組二與兩個實驗組也存在顯著性差異(P＜0.05)。兩個實驗組之間差異無顯著性(P＞0.05)。
　　(4) IFN-α OD450值，實驗組一27.7

19、3±2.83，實驗組二40.11±0.61，對照組一37.93±1.86，對照組二53.66±4.29。對照組二最高，與其它三組比較均存在顯著性差異(P＜0.05)。兩個實驗組相比差異有顯著性(P＜0.05)。實驗組二與對照組一相比差異無顯著性(P＞0.05)。實驗組一與對照組一相比存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　6.四組K562細胞β-catenin/β-actin mRNA表達值分別為:實驗組一0.0130±0.0025

20、、實驗組二0.0097±0.0020、對照組一0.0265±0.0042、對照組二0.0096±0.0027。其中，對照組一最高，與實驗組一、實驗組二及對照組二相比較均存在顯著差異(P＜0.05);實驗組一、實驗組二和對照組二兩兩相互比較差異性均不顯著(P＞0.05)。
　　7.β-catenin蛋白的Western blot檢測結果表明，四組骨髓間充質(zhì)干細胞均能表達β-catenin蛋白。采用Quantity One圖像分析軟件

21、分析β-catenin蛋白條帶的光密度值，得出β-catenin蛋白濃度由高到低依次為:對照組一、實驗組一、實驗組二和對照組二。
　　結論:
　　1.健康人來源的HMSC-hm對K562細胞的生長具有一定的抑制作用，慢性髓系白血病患者來源的CML-BMMSCs不能抑制K562細胞的生長。
　　2.兩種BMMSCs對K562細胞的不同作用可能是通過調(diào)控Toll樣受體通路活性來實現(xiàn)的。HMSC-hm通過下調(diào)IL-6和IL-