進(jìn)境水果及種苗檢疫性疫霉分子檢測方法的建立.pdf

1、疫霉屬真菌是水果及其種苗上一類非常重要的病害，其中丁香疫霉phytophthora syringae、冬生疫霉P.hibernalis、栗疫霉黑水病菌P.cambivora、草莓疫霉紅心病菌P.fragariae、樹莓疫霉根腐病菌P.fragariae var.rubi為我國禁止進(jìn)境5種檢疫性疫霉。疫霉菌侵染寄主植物引起根腐、莖腐、果腐、潰瘍等癥狀，導(dǎo)致植物大量減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)、死亡，具有流行性和毀滅性。目前疫霉菌的常規(guī)檢疫方法主要依據(jù)病

2、原菌的形態(tài)特征、生物學(xué)特性等差異，而傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法周期長，且步驟繁，已不能滿足口岸快速檢測的要求。因此，必須加大對進(jìn)境水果及其種苗檢疫性疫霉的口岸檢疫力度，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法，以保護(hù)我國水果產(chǎn)業(yè)的安全。
　　目前國內(nèi)外水果檢疫性疫霉檢測主要基于常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR，鮮有關(guān)于多重PCR和多重實(shí)時(shí)熒光PCR的報(bào)道。本研究基于柑橘屬、蘋果屬、李屬及莓類4類水果及其種苗，以5種檢疫性疫霉以及其近似種為研究對象，展開

3、了疫霉菌的分子生物學(xué)等方面的詳細(xì)研究。比較分析5種檢疫性疫霉的18S rRNA、ITS、Heat Shock Protein90(HSP90)、Ras-like Protein(Ypt1)、nad9及Enolase等多個(gè)基因，根據(jù)序列位點(diǎn)差異，分別設(shè)計(jì)了疫霉菌通用引物，5種檢疫性疫霉的特異性引物，冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的Taqman探針，建立了各類水果及其種苗上檢疫性疫霉的多重PCR、多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。本研究取得了如下

4、研究成果:
　　1、建立了柑橘屬、蘋果屬、李屬和莓類水果及其種苗上檢疫性疫霉的多重PCR檢測方法
　　通過疫霉屬多個(gè)基因序列比對，利用Primer Premier5引物軟件，針對疫霉屬真菌18S rRNA基因設(shè)計(jì)了通用引物，根據(jù)5種檢疫性疫霉的ITS、heat shock protein90、Ypt1和nad9基因分別設(shè)計(jì)了冬生疫霉、丁香疫霉、栗黑水疫霉、草莓疫霉紅心病菌和樹莓疫霉根腐病菌的特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了四

5、類水果及其種苗檢疫性疫霉的多重PCR檢測方法。利用建立的方法進(jìn)行模擬檢測試驗(yàn)，能夠有效擴(kuò)增目的片段，陰性對照沒有擴(kuò)增出條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳及EB染色，可直接讀出檢測結(jié)果。
　　2、建立了柑橘屬、蘋果屬和李屬水果及其種苗上檢疫性疫毒多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法
　　通過疫霉屬多個(gè)基因序列比對，利用Prime Primer3探針設(shè)計(jì)軟件，針對冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的Enolase、HSP90和Ypt1基因分別設(shè)

6、計(jì)了3中疫霉菌的特異性探針和引物對，經(jīng)過體系優(yōu)化，建立了柑橘屬、蘋果屬和李屬水果及其種苗上檢疫性疫霉的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法能同時(shí)檢測出各類水果的檢疫性疫霉。
　　3、建立了冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法
　　針對冬生疫霉Enolase、丁香疫霉的ITS和栗黑水疫霉Ypt1基因序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.Jp/

7、e/)在線進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。經(jīng)過體系優(yōu)化，LAMP反應(yīng)陽性樣品在2％瓊脂糖凝膠中電泳觀察均出現(xiàn)各自的特征性梯狀條帶，通過肉眼觀察到陽性反應(yīng)呈白色渾濁，加入SYBR GreenⅠ熒光染料觀察顏色均出現(xiàn)顏色變化。建立的冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的LAMP檢測方法可直接檢出反應(yīng)結(jié)果。
　　本研究建立的多重PCR、多重實(shí)時(shí)熒光PCR和LAMP檢測方法可實(shí)現(xiàn)對帶菌水果的直接檢測。全部檢測可在1d內(nèi)完成。有效促進(jìn)水果的快速通關(guān)，為口岸