草魚天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因的表達分析及其抗病相關(guān)性研究.pdf

1、近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，草魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，但是養(yǎng)殖環(huán)境卻有惡化的趨勢，草魚在養(yǎng)殖過程中爆發(fā)的疾病越來越多，給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。培育具有一定抗病力的草魚新品系是解決病害問題的有效途徑，也是實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)健康發(fā)展的一種趨勢。天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（Nramp）基因作為一種抗病候選基因，與魚類的先天性免疫密切相關(guān)，在魚類的抗病研究中具有重要價值。
　　天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（Nra

2、mp）家族是一類抑制胞內(nèi)病原菌侵染的天然免疫相關(guān)蛋白。目前在人和小鼠等哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)兩種具有不同功能的天然抗性巨噬蛋白Nramp1和Nramp2。但在魚類中，除虹鱒（Nrampα和Nrampβ）外，發(fā)現(xiàn)的Nramp蛋白只有一種，氨基酸序列對比分析研究表明，魚類的Nramp基因與哺乳類Nramp2的同源性要高于Nramp1的同源性，但其功能卻與Nramp1相似。
　　本研究以草魚（Ctenopharyngodon idellus）

3、為試驗材料，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對比研究了Nramp基因在草魚胚胎不同發(fā)育階段、不同組織及嗜水氣單胞菌攻毒感染后不同時間四個免疫相關(guān)組織的差異表達情況；通過 RT-PCR技術(shù)獲得草魚 Nramp基因ORF區(qū)，并進行了原核表達，對重組蛋白進行純化；用克隆測序的方法篩選與抗病性狀相關(guān)的SNP位點，為進一步研究Nramp的功能、生物學(xué)活性和表達調(diào)控機制，為揭示草魚免疫系統(tǒng)抗感染機制奠定了基礎(chǔ)，為草魚抗病品系的培育提供

4、參考。主要研究結(jié)果如下：
　　在草魚胚胎發(fā)育的不同時期（卵裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、心跳期、孵化期和幼魚期）Nramp基因的mRNA表達量隨著隨著胚胎的不斷發(fā)育而逐漸增強且變化顯著（P<0.05），在幼魚期表達量達到最大。Nramp基因在成年健康草魚的13個不同組織中均有不同程度的表達，在肝臟中的表達量最高；其次是在脾、頭腎、腸中的表達量較高；而在眼和鰾中的表達量最低。
　　在實驗室條件下，對草魚進行人工感染嗜水氣單胞

5、菌后，在頭腎、肝臟、脾臟、腸中Nramp的表達量都有顯著變化（P<0.05），在頭腎中感染12h后顯著上升，48h達到最大，在72h和96h時又顯著下調(diào)，在7d時表達量繼續(xù)下調(diào)而逐漸回歸到初始水平；在肝臟中Nramp基因的表達量在4h時出現(xiàn)下調(diào)，在12h又顯著上調(diào)，隨后在24h出現(xiàn)下調(diào)，在48h又上調(diào)，72h達到最大并保持較高水平到7d；在腸中mRNA表達量在12h顯著上調(diào)，48h達到最大，在72h和96h顯著下調(diào)，在7d時表達量基本回

6、歸到初始水平；在脾中mRNA表達量在4h開始上升，12h達到最大，在24h和48h表達水平顯著下調(diào)，在7d時表達量回歸到初始水平。草魚感染致病菌可引起免疫相關(guān)組織中Nramp的表達量上升，說明Nramp在硬骨魚類的天然免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。
　　從草魚組織中提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA后，利用設(shè)計的引物擴增 Nramp基因ORF區(qū)642bp片段，將目的片段雙酶切后連接到pET-32a(＋)原核表達載體上，經(jīng)酶切和測

7、序驗證，表明成功構(gòu)建了 pET-32a-Nramp原核表達載體。將重組載體轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.5 mM/L IPTG誘導(dǎo)6 h后Nramp重組蛋白獲得大量表達，且以包涵體形式存在。通過HisTrap HP純化柱純化后獲得與預(yù)期大小一致的片段，經(jīng)過Western blotting驗證了純化的蛋白是目的蛋白。這為Nramp單克隆抗體的制備和利用免疫組化及免疫印跡技術(shù)在蛋白水平研究Nramp基因表達量的變化奠定了基礎(chǔ)。

8、r>　　通過PCR克隆測序的方法篩選草魚Nramp基因多態(tài)性位點，經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)在Nramp基因3'UTR區(qū)發(fā)生C2419T突變，產(chǎn)生兩種基因型AA基因型和AB基因型。為研究該多態(tài)性位點與草魚抗病的相關(guān)性，分別對40條AA基因型和40條AB基因型魚進行嗜水氣單胞菌感染實驗，不同時間采血制備血清檢測這兩種基因型的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、堿性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性四項免疫指標，發(fā)現(xiàn)AA基因型、AB基因型這四種酶的活性都有顯著升高