燈盞乙素苷元抗腦缺血作用研究以及代謝穩(wěn)定衍生物的合成.pdf

1、本論文分為四個章節(jié)討論。
　　一、文獻研究
　　本部分對相關文獻進行整理，綜述了燈盞細辛資源利用、化學成分、藥理作用及臨床應用和燈盞乙素苷元的研究目的、研究方法和研究意義。
　　二、燈盞乙素苷元體內過程研究
　　（一）大鼠灌胃燈盞乙素苷元血漿、尿液和糞便中主要代謝產物的鑒定
　　本部分采用超高效液相與四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)技術，利用碰撞能量梯度(MSE)和質量虧損過濾(MDF

2、)技術對大鼠灌胃燈盞乙素苷元后在血漿、尿液和糞便中燈盞乙素苷元及其代謝產物進行了分析。結果顯示，在大鼠尿液中可檢測到燈盞乙素苷元(M1)、野黃芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(M2)，野黃芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(M3)，燈盞乙素(M4)、野黃芩素二葡萄糖醛酸苷(M5)、芹菜素葡萄糖醛酸苷(M6)、野黃芩素-4'-O-硫酸酯(M7)、野黃芩素甲醚(M8)和野黃芩素葡萄糖醛酸苷甲醚(M9);在血漿中可檢測到M1、M2、M4和野

3、黃芩素乙酸酯(M10);在糞便中沒有發(fā)現(xiàn)原型藥物，僅有1個Ⅱ相代謝產物(M10)。提示燈盞乙素苷元在大鼠體內可能主要以葡萄糖醛酸化、脫氧葡萄糖醛酸結合、硫酸化、甲基化、乙?；刃问酱x。
　　（二）燈盞乙素苷元在正常和模型大鼠體內的藥動學及組織分布研究
　　本部分建立了大鼠體內燈盞乙素苷元的UPLC-MS測定方法，研究正常和模型大鼠分別灌胃和尾靜脈給藥后燈盞乙素苷元的藥動學及組織分布特性。采用反復雙側頸總動脈結扎建立大鼠腦部

4、缺血再灌注模型，分別等劑量灌胃和尾靜脈注射燈盞乙素苷元34mg·kg-1，UPLC-MS測定體內燈盞乙素苷元和燈盞乙素及組織中燈盞乙素苷元的濃度。結果顯示，血漿中燈盞乙素苷元(1.05-1.05×104 ng·mL-1)及代謝產物燈盞乙素(2.38-2.38×103 ng·mL-1)線性關系良好。燈盞乙素苷元在正常大鼠中生物利用度為2.57％，而在模型組大鼠中生物利用度為3.22％。提示，在病理狀態(tài)下，有利于燈盞乙素苷元生物利用。燈盞乙

5、素苷元在腦中含量最高，其次是腎、脾、心臟、肺和肝臟。
　　三、燈盞乙素苷元抗腦缺血有效性及作用機制初步研究
　　（一）燈盞乙素及苷元與牛血清蛋白的結合及分子對接研究
　　本部分采用平衡透析法和高效液相色譜法測定燈盞乙素和燈盞乙素苷元與小牛血清蛋白的結合率。同時采用熒光光譜法研究藥物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。采用標記競爭實驗和分子對接技術研究藥物與血清蛋白的結合位點。結果顯示，燈盞乙素和燈盞乙素苷元與小牛血清蛋

6、白之間結合率分別為(79.85±1.83)％和(85.49±1.21)％。燈盞乙素和燈盞乙素苷元與BSA的結合猝滅機制均是靜態(tài)淬滅。熱力學參數(shù)表明，范德華力和氫鍵是燈盞乙素和燈盞乙素苷元與BSA之間的主要作用力，其中，燈盞乙素苷元更容易與BSA相結合。標記競爭實驗發(fā)現(xiàn)燈盞乙素和燈盞乙素苷元主要結合在BSA的IIA。此外，分子對接實驗表明，一個BSA可以結合三個燈盞乙素苷元，而一個BSA只可以結合兩個燈盞乙素。提示燈盞乙素和燈盞乙素苷元與

7、小牛血清發(fā)生中等以上強度的結合，此外，燈盞乙素苷元比燈盞乙素蛋白結合力強。
　?。ǘ舯K乙素苷元對腦缺血損傷的保護作用
　　本部分探討了燈盞乙素苷元預處理對腦缺血再灌注損傷的保護作用。首次采用HILIC模式下的UPLC-MS/MS技術建立無需衍生化直接測定缺血腦組織中內源性氨基酸的含量測定方法，通過試劑盒測定大鼠缺血腦組織中Ca2+濃度和Ca2+-ATP酶活性。結果發(fā)現(xiàn)在17 min內同時測定腦缺血再灌注大鼠缺血腦內谷氨酸

8、(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸（γ-GABA）等17種氨基酸類神經(jīng)遞質的含量。各氨基酸標準曲線在檢測范圍內均呈良好的線性(r2＞0.9999)。與假手術組相比，腦缺血再灌注組大鼠缺血腦組織中Glu、Asp、Gly等興奮性氨基酸含量顯著升高，而γ-GABA、Tau等抑制性氨基酸亦明顯升高。而細胞內Ca2+濃度和Ca2+-ATP酶活性顯著升高。燈盞乙素苷元預處理組能顯著降低興奮性氨基酸，Ca2+濃度含量和C

9、a2+-ATP酶活性，而抑制性氨基酸含量相應有所升高。與等劑量燈盞乙素組相比，燈盞乙素苷元具有更顯著的差異。燈盞乙素苷元可能通過調節(jié)大鼠缺血再灌注后的氨基酸代謝紊亂，減輕鈣超載，降低Ca2+-ATP酶活性，發(fā)揮保護腦組織，減輕缺血再灌注損傷的作用。
　　（三）不同燈盞乙素及苷元的劑量對實驗性腦缺血的保護作用及量效關系研究
　　本部分主要探討不同劑量的燈盞乙素及燈盞乙素苷元治療大鼠反復缺血再灌注損傷的量效關系。燈盞乙素和燈盞乙

10、素苷元(0.09，0.17，0.35，0.70，1.40 mmol·kg-1)連續(xù)灌胃7d后，采用反復雙側頸總動脈結扎造成大鼠腦缺血再灌注模型，觀察腦組織病理改變、腦含水量和腦組織中Na+，K+，Ca2+，MDA含量及SOD，Ca2+-ATPase和Na+，K+-ATPase活性，采用HILIC模式下的UPLC-MS/MS技術直接測定缺血腦組織中內源性氨基酸。結果與模型組相比，燈盞乙素和燈盞乙素苷元預處理能夠改善神經(jīng)細胞損傷，減輕腦水腫

11、，提高SOD活力，降低MDA含量。調節(jié)谷氨酸(Glu)，天門冬氨酸(Asp)，甘氨酸(Gly)，γ-氨基丁酸(GABA)和?；撬?Tau)，提高Ca2+-ATPase和Na+，K+-ATPase活性。提示燈盞乙素和燈盞乙素苷元可改善缺血再灌注神經(jīng)損傷，可能通過清除自由基，抑制脂質過氧化物的生成，調節(jié)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸，發(fā)揮保護腦組織的作用。同時燈盞乙素苷元的保護作用要好于燈盞乙素，燈盞乙素苷元最有效劑量為0.35mmol·kg-

12、1。
　?。ㄋ模舯K乙素苷元調控腦缺血潛在生物標志物的機制研究
　　通過對缺血再灌注損傷的代謝組學研究，確定能夠表征缺血性腦損傷發(fā)生、發(fā)展和恢復狀態(tài)的生物標記物，并基于此標記物的代謝軌跡變化闡述燈盞乙素和燈盞乙素苷元腦損傷的保護作用。采用反復雙側頸總結扎，建立大鼠腦缺血再灌注模型，將大鼠分為假手術組、模型組、尼莫地平組、燈盞乙素和燈盞乙素苷元組。基于代謝組學理論，采用超高效液相色譜-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)

13、方法，對大鼠尿液、血漿和腦組織中內源性代謝成分進行分離測定，以主成分分析方法為數(shù)據(jù)分析方法。通過獨特通路分析(MetPA)，構建代謝組學特征網(wǎng)絡圖。初步鑒定出對模型組和空白組的分類具有顯著貢獻的23個潛在的生物標志物（尿液中9個，缺血腦組織中8個和血漿中6個）。通過代謝通路分析，在尿液中11條代謝通路，缺血組織中14條代謝和血漿中3條代謝通路被發(fā)現(xiàn)。這些內源性代謝產物主要參與了sphingolipid metabolism，lysine

14、 biosynthesis及alanine，aspartate和glutamate metabolism。灌胃燈盞乙素和燈盞乙素苷元后，紊亂的代謝產物含量恢復到健康水平。此外，通過PLS-DA score plots圖中相對距離分析，灌胃燈盞乙素苷元后療效好于燈盞乙素。燈盞乙素和燈盞乙素苷元可能通過參與調節(jié)的sphingolipid metabolism, lysine biosynthesis及alanine, aspartate和g