WNT通路抑制因子的甲基化在大腸側向發(fā)育型腫瘤(LST)中作用的實驗研究.pdf

1、一、目的與意義
　　 大腸側向發(fā)育性腫瘤是一類主要沿粘膜表面呈側向淺表擴散,具有與其大小不相稱的高惡變潛能的表淺型大腸腫瘤。目前對該腫瘤的研究還停留在臨床的內鏡下診斷及治療方面。
　　 就形態(tài)上而言,早期大腸癌可以被分為兩種,一種是隆起型,另一種是平坦型。但是到目前為止,有關于平坦型大腸腫瘤的準確的表觀遺傳方面的變化知之甚少。
　　 越來越多的證據表明平坦型的大腸癌可以解釋大約10％-20％的大腸癌?，F(xiàn)在仍然存在

2、有關平坦型與隆起型腫瘤的起源和進展的爭論。
　　 Wnt 介導的信號途徑可受胞外分泌蛋白的調節(jié).有兩類 Wnt的拮抗物:第一包括分泌的Frizzled 相關蛋白(sFRP)家族,Wnt 抑制因子-1(WIF-1)和Cerberus,通過直接與 Wnt 分子結合而抑制 Wnt 信號傳導:第二類包括 DKK 家族,通過與 Wnt受體復合體 LRP5/L 和LRP6的結合而抑制 Wnt 信號傳導。LRP5/6 和Dkk 低密度脂蛋白的

3、受體相關蛋白(LRP,low-density lipoprotein-receptor-relatedprotein)是一類在脂代謝中具有重要作用的蛋白家族,其中哺乳動物的LRP-5,6 和果蠅中的Arrow 具有高度的同源性,同屬一個亞家族.新近的研究發(fā)現(xiàn),LRP-5/6 在WNT信號通路中具有重要的作用.他們的結構特點是,均含有三個保守的區(qū)域:(1)胞外區(qū),具有表皮生長因子(EGF,epidermal.growth factor)重

4、復序列和LDLR(low-density lipoprotein-receptor)重復序列,(2)跨膜區(qū),(3)胞內區(qū).LRP-5/6 胞外區(qū)可以結合 WNT 蛋白,和Frizzled 受體相互作用將信號從胞外傳入胞內。已有研究結果表明,胞內區(qū)并未見明顯的催化活性的結構,在 WNT 信號存在時,LRP-5 胞內區(qū)可以募集 AXIN 并使其降解,從而激活 WNT 通路。Dkk1(dikkopfl)作為WNT胞外的抑制子,正是通過結合其受

5、體 LRP6 發(fā)揮作用的。
　　 根據 Wnt 蛋白轉導信號的方式,將Wnt信號途徑分為經典途徑(canonicalWnt signal pathway)和非經典的途徑(noncanonical Wnt signal pathway)。經典 Wnt/β-catenin 信號途徑。Wnt 蛋白在胞膜上與一種卷曲蛋白(frizzled,Frz)的跨膜受體相結合,同時結合的還有低密度脂蛋白受體相關蛋白(lowdensity lipop

6、rotein receptor related protein 5 and 6,LRP5/6),這是 Wnt信號通路活化的重要起始信號。通過這些受體復合物將信號傳至胞質內,激活一系列蛋白的活性,包括散亂蛋白(dishevelled,Dsh)、糖原合成酶激酶(GSK-3β)、APC(andenomatous polyposis coli)、軸蛋白(AXIN)和轉錄調節(jié)劑 β-catenin。Wnt 和Frz 受體的結合被 WIF1 和分泌

7、性Frz 相關蛋白(secretedfrizzled-related proteins,SFRPs)競爭性抑制,而 Dickko 家族(DKK-1,DKK-2)通過間接減少可利用的輔助受體LRP的數量來間接抑制Wnt與膜受體的結合。
　　 在正常情況下胞質內 β-catenin的水平被多蛋白降解復合體調控,這組復合體包括 APC、AXIN、GSK-3β和酪蛋白激酶 1α/ε(CK1α/ε),復合體的功能可使 β-catenin

8、磷酸化,而后被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。所以正常情況下,胞質內游離 β-catenin 處于極低的水平。一旦 Wnt 蛋白與受體 Frz 結合,可使胞質 Dsh 激活而被磷酸化,進一步與APC結合,抑制 GSK-3 β的活性,使 β-catenin不能被磷酸化,導致 β-catenin 在胞質內積累繼而入胞核,與核內轉錄因子 TCF/LEF(T cell factor/lymphoid enhancer factor)形成復合體,激活一系

9、列Wnt 信號靶基因的轉錄,包括c-myc、cyclinD1、MMP-7 和免疫球蛋白轉錄因子2(ITF-2)。核內 β-catenin的出現(xiàn)是Wnt信號通路激活的標志。β-catenin 是Wnt 信號通路的正向調節(jié)因子,而 APC,AXIN,GSK-3 β等則是負向調節(jié)因子。
　　 非經典的Wnt 信號途徑 Wnt 蛋白與受體的結合也可以通過其他兩種途徑激活信號轉導。其一,與某些 Frz 受體的結合可以使細胞內鈣離子釋放,激

10、活蛋白激酶 C(PKC)。其二,Dsh 激活Jun-N末端激酶(JNK)通路,從而調控細胞支架重排以及細胞的極性。非經典的Wnt信號途徑在腫瘤中的作用尚不明了。
　　 Wnt 信號途徑的抑制因子在腫瘤的作用越來越受到重視,本研究即著重于Wnt 信號途徑的抑制因子的甲基化在側向發(fā)育型腫瘤的研究。
　　 二、方法與內容
　　 材料和方法
　　 Wnt 信號通路在原發(fā)性結直腸腫瘤中的活性研究。
　　 1

11、、103 例腫瘤標本(包括 52 例側向發(fā)育型腫瘤和51 例隆起型腺瘤)來自南方醫(yī)院消化科 2006年-2009 年內鏡切除的標本,所有標本經過福爾馬林固定,石蠟包埋。103 例腺瘤標本收集到新鮮腫瘤標本的有59例(包括32例側向發(fā)育型腫瘤和27例隆起型腺瘤),59例腫瘤標本中,我們收集到腫瘤組織及腫瘤旁的正常組織,新鮮標本立即置入組織保存液(大連寶生物工程有限公司),-80℃低溫冰箱保存。
　　 2、采用半定量 RT-PCR

12、方法,檢測結直腸腫瘤組織中 wnt 信號通路關鍵分子 SFRP1、SFRP2、SFRP5mRNA的表達水平。所有標本經過反轉錄 PCR(reversetranscriptase PCR RT-PCR)用01ympus-CRI(Creative Realities,Inc.)顯微攝像系統(tǒng)拍攝圖片,并用圖像分析軟件 Image Pro plus 6.0分析各圖片累積光密度(integrated optical density,IOD)和陽性

13、表達面積(stained area,SA),計算平均光密度(Mean density,MD),即 MD=IOD/SA。
　　 3、通過甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)檢檢測結直腸腫瘤組織中 wnt 信號通路關鍵分子 SFRP1、SFRP2和SFRP5的的甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽修飾后的DNA 作為 MSP的模板,采用對甲基化或非甲基化序列特異的引物進行擴增。擴增產物在2％的瓊脂糖凝膠上

14、分離,EB 染色,紫外燈下成像觀察。
　　 4、采用免疫組織化學方法,檢測結直腸腫瘤組織中 SFRP1 蛋白質的表達,并采用半定量方法對組織化學染色進行評分。
　　 5、去甲基化試驗 在結腸癌 HCT116 細胞株中進行去甲基化試驗,10 μM 5-氮-2-脫氧胞苷(5-aza-dCyd)去甲基化處理 HCT116 細胞株 5 天,對照組僅給予 PBS 處理,同樣條件下培養(yǎng)。每個細胞株均進行 3 次重復獨立試驗。觀察去甲

15、基化處理對 HCT116 細胞株 SFRP1、SFRP2、和SFRP5mRNA表達的影響。
　　 6 統(tǒng)計學處理
　　 計量資料以 X±SD 表示,計數資料以百分比(％)表示。采用 SPSS13.0 對數據進行分析,連續(xù)變量兩組間比較采用獨立 t 檢驗或 Mann-Whitney U 檢驗。分類變量兩組間比較采用 x 2 檢驗或 Fisher 精確概率法,P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學顯著性,所有檢驗均為雙側。
　

16、　 三、結果與分析
　　 結果
　　 早期 CRC 中存在Wnt信號通路的sFRP1 過度甲基化。sFRP1、2、5在正常大腸黏膜甲基化率分別為 13.6％(8/59)、28.8％(17/59)、27.1％(16/59)。sFRP1、2、5在LSTs 甲基化率分別為 61.5％(32/52)、65.4％(34/52)、55.8％(29/52)；sFRP1、2、5在PAs 中分別為 39.2％(20/51)、54.9％(

17、28/51)、60.8％(31/51):LSTs和Pas與正常黏膜比較 sFRP1、2、5差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。LSTs 與 PAs 比較,sFRP2、5 沒有統(tǒng)計學意義(均P>0.05),sFRP1 有統(tǒng)計學意義(P=0.030)。sFRP2、5 mRNA 在 LSTs組和PAs 組中無顯著差異；與 PAs 組相比,LSTs 組 sFRP1 mRNA 水平(t=-3.239,P=0.002)顯著降低。相應的,sFRP1

18、 蛋白(Mann-Whitney U 檢驗,Z=-2.973,P=0.003)在 PAs 組的表達顯著高于LSTs組；sFRP1蛋白在Pas組常常有陽性表達。
　　 四、結論
　　 甲基化作用在大腸側向發(fā)育性腫瘤機制:LST的病因及病理機制仍然未完全明確,目前尚未闡明。
　　 1.SFRP1 表達缺失或下調可能是大腸側向發(fā)育型腫瘤的一個重要特征。
　　 2.SFRP1的甲基化在大腸側向發(fā)育型腫瘤發(fā)生中起重