舌苔形成的基因表達(dá)譜和EGF-R相關(guān)信號(hào)通路機(jī)制研究.pdf

1、目的： 舌診在中醫(yī)臨床疾病診斷中起著重要作用，其中舌苔（包括苔色和苔質(zhì)）在辨證中的價(jià)值最大，舌苔形成的原理及其客觀化研究是中醫(yī)現(xiàn)代化基礎(chǔ)研究中的一個(gè)重大的關(guān)鍵性課題。舌苔的形成與舌粘膜上皮細(xì)胞的分裂，增殖、分化、遷移和脫落密切相關(guān)，與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)差異密切相關(guān)。因此，本文從臨床樣本和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兩個(gè)方面，研究了不同舌苔粘膜組織的基因表達(dá)譜，探索EGF和TGF-α對(duì)舌背粘膜上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布和凋亡，信號(hào)途徑相關(guān)分子的影響，

2、為更深入研究舌苔形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 方法： 臨床收集舌鱗癌患者術(shù)后癌周正常舌背粘膜，分為薄白苔、白厚苔、黃薄苔、黃厚苔、剝苔等5組，以胎兒薄白苔對(duì)照，利用基因芯片技術(shù)聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究不同舌苔的基因表達(dá)譜。 取臨床舌鱗癌患者術(shù)后癌周正常舌背粘膜組織作為對(duì)照，健康的大鼠、小鼠和兔處死后取舌背粘膜組織，dispaseⅡ和胰蛋白酶處理分離舌背粘膜上皮細(xì)胞，體外10％血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)不同

3、時(shí)段，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。分析人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物舌背粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞行為相似性，研究EGF對(duì)小鼠、大鼠、兔的細(xì)胞周期分布和凋亡影響。 在無血清培養(yǎng)基K-SFM中，初步研究了EGF和TGF-α調(diào)控舌苔形成的差異機(jī)制，利用MTT法研究大鼠舌背粘膜上皮細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞周期分布和凋亡，細(xì)胞免疫組織化學(xué)法研究CK4、p38-MAP kinase、c-fos、c-myc和NF-κB的表達(dá)水平。 結(jié)果：

4、 基因表達(dá)譜結(jié)果顯示，與胎兒薄白苔相比，60個(gè)基因在5種常見舌苔中同時(shí)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，包括21個(gè)上調(diào)基因和39個(gè)下調(diào)基因，這些基因均與舌背粘膜上皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡和脫落相關(guān)，參與舌背粘膜上皮的損傷、修復(fù)和重建。 人、大鼠、小鼠、兔的舌背粘膜上皮細(xì)胞周期分布和凋亡比較顯示，大鼠舌背粘膜上皮凋亡趨勢與人最為接近。利用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠、小鼠、兔的舌背粘膜上皮細(xì)胞，結(jié)果表明：EGF對(duì)小鼠和兔舌背粘膜上皮細(xì)胞均表現(xiàn)為抗凋

5、亡作用，但不顯示濃度依賴性：此外，EGF和TGF-α可以促進(jìn)大鼠舌背粘膜上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生，且細(xì)胞周期分布不一致。 利用含不同濃度EGF和TGF-α的無血清培養(yǎng)基K-SFM體外培養(yǎng)大鼠舌背粘膜上皮細(xì)胞，隨著時(shí)間推移，細(xì)胞增殖活性逐漸下降，與細(xì)胞凋亡率變化基本一致。細(xì)胞凋亡率具有濃度依賴性，隨著EGF和TGF-α的濃度升高，細(xì)胞凋亡率表現(xiàn)為下降趨勢。EGF和TGF-α可以降低CK4的表達(dá)水平，其中1μg/L和10μg/L濃度表達(dá)水平

6、下降最明顯，而5μg/L EGF和TGF-α對(duì)CK4表達(dá)水平下降較少；EGF和TGF-α可以上調(diào)p38-MAP kinase、c-myc和c-fos表達(dá)水平，卻下調(diào)NF-κB表達(dá)水平；不同濃度EGF和TGF-α對(duì)相關(guān)分子表達(dá)影響具有相同的趨勢，但相同濃度作用后相關(guān)分子表達(dá)量不同。EGF上調(diào)大鼠舌背粘膜上皮細(xì)胞p38-MAP kinase和c-myc的作用強(qiáng)于TGF-α，而EGF上調(diào)c-fos的作用弱于TGF-α；EGF下調(diào)NF-κB p

7、65和p50的作用不如TGF-α更明顯，從陽性目標(biāo)平均光密度值看，NF-κB p50的表達(dá)水平高于NF-κBp65。 結(jié)論： 在參與舌苔形成的基因中，EGF和TGF-α是兩個(gè)關(guān)鍵分子，雖然它們可以競爭性結(jié)合共同的細(xì)胞受體EGF-R，但對(duì)細(xì)胞周期分布和凋亡的影響不同，提示它們?cè)谏嗵π纬芍械墓δ懿煌?以大鼠舌背粘膜上皮細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，研究EGF和TGF-α對(duì)p38-MAPkinase、c-myc、c-fos和