B-RAF基因及MAPK信號轉導通路和胃癌相關性及其機制的研究.pdf

1、本文研究了B-RAF基因及MAPK信號轉導通路和胃癌相關性及其機制。 研究方法：應用PCR-DHPLC結合DNA測序技術篩查B-RAF基因點突變；免疫組化和Western Blot檢測胃癌組織中B-RAF蛋白表達。針對B-RAF基因和RelA基因設計siRNA，體外轉錄合成B-RAF-siRNA和RelA-siRNA，利用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000將其分別轉染胃癌細胞系BGC823細胞。RT-PCR和We

2、sternBlot檢測胃癌BGC823細胞中B-RAF基因和．RelA基因的表達；MTT、流式細胞術、Transwell和RT-PCR以及Western Blot分別檢測B-RAF基因和RelA基因表達抑制后對胃癌細胞系BGC823細胞生物學特性的影響以及分子機制；免疫沉淀技術結合蛋白質的質譜分析技術研究可能與B-RAF蛋白結合的未知蛋白；利用GGTI-298和FTI-277處理胃癌細胞系BGC823細胞，Western：Blot檢測二

3、種抑制劑對胃癌細胞中B-RAF基因表達的影響；利用生物信息學轉錄因子預測軟件預測可能與B-RAF基因上游啟動子區(qū)特異序列結合的轉錄因子，并用染色質免疫沉淀技術結合PCR技術對生物信息學轉錄因子預測軟件預測的結果進行驗證。 研究結果： 1．人胃癌組織中B-RAF基因突變篩查結果： 在150例人胃癌組織和癌旁組織標本中未篩查到B-RAF基因第11外顯子和第15外顯子存在突變。 2．人胃癌組織中B-RAF蛋白表

4、達分析： 免疫組化結果顯示在20例人胃癌組織標本中，胃癌細胞中可見棕色顆粒，主要分布于細胞質，B-RAF蛋白表達陽性，而正常胃腺細胞中未見棕色顆粒，B-RAF蛋白表達陰性。 3．B-RAF-siRNA對胃癌細胞中B-RAFmRNA表達的影響： B-RAF-siRNA轉染BGC823細胞第5和第7天時B-RAF mRNA表達水平可見到明顯變化，B-RAF-siRNA組較對照組B-RAFmRNA表達水平明顯降低。

5、 4．B-RAF-siRNA對胃癌細胞中B-RAF蛋白表達的影響： B-RAF-siRNA轉染BGC823細胞第9天時B-RAF蛋白表達水平可見到明顯變化，B-RAF-siRNA組較對照組B-RAF蛋白表達水平明顯降低，表明B-RAF蛋白表達受到抑制。 5．B-RAF-siRNA對人胃癌BGC823細胞生長的影響與細胞對照組相比，B-RAF-siRNA對體外培養(yǎng)的胃癌BGC823細胞的生長有明顯抑制作用。其中，轉染后

6、72h抑制率達20％。 6．B-RAF-siRNA對胃癌細胞凋亡的影響B(tài)-RAF-siRNA組胃癌BGC823細胞凋亡率為19.58％，B-RAF-siRNA組較對照組胃癌BGC823細胞凋亡率明顯升高，說明B-RAF基因抑制能夠引起胃癌BGC823細胞凋亡。 7．B-RAF-siRNA抑制人胃癌BGC823細胞中BCZ-2 mRNA的表達。 8．B-RAF-siRNA對細胞侵襲力的影響B(tài)-RAF-siRNA轉染

7、后第9天，細胞侵襲力明顯降低。 9．RAPl抑制劑GGTI-298和RAS抑制劑FTI-277均明顯抑制胃癌BGC823細胞中B-RAF mRNA和蛋白的表達。 10．RelA-siRNA對胃癌BGC823細胞中B-RAF蛋白表達的影響RelA-siRNA有效地抑制RelA基因表達后，胃癌BGC823細胞中B-RAF蛋白表達水平也明顯降低。 11．免疫沉淀技術結合質譜分析結果胃癌BGC823細胞中B-RAF蛋白可

8、能與PR02619蛋白結合。 12．染色質免疫沉淀技術結合PCR技術檢測結果在NF-KB抗體免疫沉淀的DNA片斷中含有B-RAF基因的啟動子區(qū)NF-kB蛋白的結合序列。 研究結論： 1．B-RAF基因點突變可能不是B-RAF基因參與胃癌發(fā)生的途徑。 2．B-RAF基因表達增高可能與胃癌發(fā)生密切相關。 3．B-RAF基因是與胃癌相關的重要癌基因，促進胃癌細胞的生長增殖、抑制細胞凋亡和增強胃癌細胞的侵