B-RAF基因及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和胃癌相關(guān)性及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文研究了B-RAF基因及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和胃癌相關(guān)性及其機(jī)制。 研究方法：應(yīng)用PCR-DHPLC結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)篩查B-RAF基因點(diǎn)突變；免疫組化和Western Blot檢測(cè)胃癌組織中B-RAF蛋白表達(dá)。針對(duì)B-RAF基因和RelA基因設(shè)計(jì)siRNA，體外轉(zhuǎn)錄合成B-RAF-siRNA和RelA-siRNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將其分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞。RT-PCR和We

2、sternBlot檢測(cè)胃癌BGC823細(xì)胞中B-RAF基因和．RelA基因的表達(dá)；MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell和RT-PCR以及Western Blot分別檢測(cè)B-RAF基因和RelA基因表達(dá)抑制后對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞生物學(xué)特性的影響以及分子機(jī)制；免疫沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)研究可能與B-RAF蛋白結(jié)合的未知蛋白；利用GGTI-298和FTI-277處理胃癌細(xì)胞系BGC823細(xì)胞，Western：Blot檢測(cè)二

3、種抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞中B-RAF基因表達(dá)的影響；利用生物信息學(xué)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)可能與B-RAF基因上游啟動(dòng)子區(qū)特異序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)生物信息學(xué)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 研究結(jié)果： 1．人胃癌組織中B-RAF基因突變篩查結(jié)果： 在150例人胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本中未篩查到B-RAF基因第11外顯子和第15外顯子存在突變。 2．人胃癌組織中B-RAF蛋白表

4、達(dá)分析： 免疫組化結(jié)果顯示在20例人胃癌組織標(biāo)本中，胃癌細(xì)胞中可見(jiàn)棕色顆粒，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，B-RAF蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而正常胃腺細(xì)胞中未見(jiàn)棕色顆粒，B-RAF蛋白表達(dá)陰性。 3．B-RAF-siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞中B-RAFmRNA表達(dá)的影響： B-RAF-siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞第5和第7天時(shí)B-RAF mRNA表達(dá)水平可見(jiàn)到明顯變化，B-RAF-siRNA組較對(duì)照組B-RAFmRNA表達(dá)水平明顯降低。

5、 4．B-RAF-siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞中B-RAF蛋白表達(dá)的影響： B-RAF-siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞第9天時(shí)B-RAF蛋白表達(dá)水平可見(jiàn)到明顯變化，B-RAF-siRNA組較對(duì)照組B-RAF蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明B-RAF蛋白表達(dá)受到抑制。 5．B-RAF-siRNA對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與細(xì)胞對(duì)照組相比，B-RAF-siRNA對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。其中，轉(zhuǎn)染后

6、72h抑制率達(dá)20％。 6．B-RAF-siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響B(tài)-RAF-siRNA組胃癌BGC823細(xì)胞凋亡率為19.58％，B-RAF-siRNA組較對(duì)照組胃癌BGC823細(xì)胞凋亡率明顯升高，說(shuō)明B-RAF基因抑制能夠引起胃癌BGC823細(xì)胞凋亡。 7．B-RAF-siRNA抑制人胃癌BGC823細(xì)胞中BCZ-2 mRNA的表達(dá)。 8．B-RAF-siRNA對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響B(tài)-RAF-siRNA轉(zhuǎn)染

7、后第9天，細(xì)胞侵襲力明顯降低。 9．RAPl抑制劑GGTI-298和RAS抑制劑FTI-277均明顯抑制胃癌BGC823細(xì)胞中B-RAF mRNA和蛋白的表達(dá)。 10．RelA-siRNA對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞中B-RAF蛋白表達(dá)的影響RelA-siRNA有效地抑制RelA基因表達(dá)后，胃癌BGC823細(xì)胞中B-RAF蛋白表達(dá)水平也明顯降低。 11．免疫沉淀技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果胃癌BGC823細(xì)胞中B-RAF蛋白可

8、能與PR02619蛋白結(jié)合。 12．染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果在NF-KB抗體免疫沉淀的DNA片斷中含有B-RAF基因的啟動(dòng)子區(qū)NF-kB蛋白的結(jié)合序列。 研究結(jié)論： 1．B-RAF基因點(diǎn)突變可能不是B-RAF基因參與胃癌發(fā)生的途徑。 2．B-RAF基因表達(dá)增高可能與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。 3．B-RAF基因是與胃癌相關(guān)的重要癌基因，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、抑制細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵