人胰腺癌細(xì)胞系與大鼠背根神經(jīng)節(jié)體外共培養(yǎng)的研究.pdf

1、目的：胰腺癌(PanCa)是惡性程度很高的惡性腫瘤之一，早期即會(huì)發(fā)生淋巴管、血管、肝臟轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。嗜神經(jīng)浸潤(rùn)(PNI)是胰腺癌的重要特征，并且與胰腺癌術(shù)后的腹膜后腫瘤復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一，然而PNI的具體發(fā)生機(jī)制尚不清楚。Ayala等使用前列腺癌細(xì)胞系與大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)共培養(yǎng)建立了前列腺癌細(xì)胞/DRGs體外共培養(yǎng)模型，應(yīng)用于前列腺癌嗜神經(jīng)浸潤(rùn)的研究，證實(shí)前列腺癌嗜神經(jīng)浸潤(rùn)是涉及到前列腺癌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞

2、或者膠質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)的相互作用的過(guò)程。本研究的研究目的在于建立一種新的體外胰腺癌嗜神經(jīng)浸潤(rùn)研究模型，并觀察嗜神經(jīng)浸潤(rùn)過(guò)程中神經(jīng)突的生長(zhǎng)狀況、胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移情況。 方法：自4～6周齡Wistar大鼠的頸部、胸部和腰部取DRGs。人胰腺癌細(xì)胞系(MIAPaCa-2)常規(guī)培養(yǎng)后，取DRGs與人胰腺癌細(xì)胞系于Matrigel膠中共培養(yǎng)建立研究模型。倒置顯微鏡下于24h、48h、72h、96h、120h及144h觀察胰腺癌細(xì)胞集

3、落形成和DRGs神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)情況以及胰腺癌細(xì)胞的遷移情況，并用Image-ProPlus5.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析、神經(jīng)突計(jì)數(shù)、計(jì)算神經(jīng)突和胰腺癌細(xì)胞集落所占的面積。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞Ki-67增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)情況，并計(jì)算胰腺癌細(xì)胞增殖率(proliferationindex，PI)；MTT法檢測(cè)吸光度值(A)，反映胰腺癌細(xì)胞的增殖情況。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的凋亡率(apoptosisindex,AI)。

4、 結(jié)果：背根神經(jīng)節(jié)位于脊髓腹側(cè)脊神經(jīng)后根出椎管處，附著在后根，大小約1～2mm，呈淺黃色，圓形，表面光滑。共培養(yǎng)模型中神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照組，72小時(shí)后，神經(jīng)突所占據(jù)的面積約為對(duì)照組的2.57倍(P<0.001)；共培養(yǎng)模型中MIAPaCa-2胰腺癌細(xì)胞集落生長(zhǎng)速度也快于對(duì)照組，72小時(shí)后，細(xì)胞集落所占據(jù)的面積約為對(duì)照組的1.33倍(P<0.001)。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突有明顯的向胰腺癌細(xì)胞集落方向生長(zhǎng)的趨勢(shì)，而神

5、經(jīng)突與胰腺癌細(xì)胞集落接觸后，則出現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞沿神經(jīng)突生長(zhǎng)的方向逆向遷移，最終到達(dá)背根神經(jīng)節(jié)周?chē)霈F(xiàn)類(lèi)似PNI的表現(xiàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，上清液培養(yǎng)組中腫瘤細(xì)胞的Ki-67增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)陽(yáng)性率明顯增高，實(shí)驗(yàn)組PI平均值為12.80±1.84％(9.8％～15.3％)，而對(duì)照組其PI平均值為6.81±0.73％(5.8％～8.3％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。而MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組吸光度遠(yuǎn)高于對(duì)照組，MTT與免疫細(xì)胞化

6、學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明實(shí)驗(yàn)組胰腺癌細(xì)胞的增殖遠(yuǎn)比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組中的胰腺癌細(xì)胞活躍。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，上清液培養(yǎng)組胰腺癌細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，24小時(shí)培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組胰腺癌細(xì)胞AI值為2.46±0.37％，而對(duì)照組AI值為4.89±0.63％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 結(jié)論：人胰腺癌細(xì)胞系(MIAPaCa-2)/DRGs共培養(yǎng)模型成功構(gòu)建，有助于胰腺癌嗜神經(jīng)浸潤(rùn)的研究。神經(jīng)細(xì)胞-胰腺癌細(xì)胞的相互作用在胰腺癌的嗜神經(jīng)浸