脂肪干細(xì)胞與PLCL-P123靜電紡納米材料構(gòu)建組織工程皮膚促創(chuàng)面愈合的研究.pdf

1、目的：
　　對于嚴(yán)重?zé)齻C械傷致大面積的皮膚組織缺損的治療一直來是整形外科創(chuàng)面愈合研究領(lǐng)域的難點。目前臨床上常采用自體皮瓣或皮片移植來修復(fù)，但是由于自體皮瓣或皮片的組織量有限，尚無法滿足臨床的應(yīng)用。臨床上常采用人工皮膚或者異體皮膚來修復(fù)。異體皮供應(yīng)有限，故人們把眼光聚焦于人工皮膚。近年組織工程技術(shù)的進(jìn)步，采用組織工程皮膚來修復(fù)大面積皮膚缺損得到大家認(rèn)同。對于組織工程皮膚目前研究較多，但尚未找到一種理想的人工皮膚。因此探索一種接近

2、正常皮膚結(jié)構(gòu)和生理特性的皮膚替代物成為必要。
　　納米技術(shù)為新型仿生生物活性材料的合成制作提供了新的途徑和思路。皮膚組織工程支架材料主要采用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建，其與傳統(tǒng)支架比較的優(yōu)點包括[1，2]:①特殊的三維多孔結(jié)構(gòu)，各孔之間相互貫通，對支架上生長細(xì)胞的營養(yǎng)和代謝需求具有優(yōu)勢:②具有超過其他形式材料的體表面積，為細(xì)胞的粘附和功能性蛋白的附著提供了良好的條件;③皮膚表皮層的厚度為0.2～0.25mm，真皮層厚度約為0.4～0.45m

3、m，而靜電紡絲材料的厚度可在0.05～2mm之間，這使得靜電紡的材料在幾何尺寸上與細(xì)胞外基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)存在一致性，因此靜電紡納米材料可以模擬皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，達(dá)到更好模擬皮膚的作用。
　　本實驗通過從SD大鼠分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，將之與靜電紡的聚乳酸-聚己內(nèi)酯/泊洛沙姆納米支架(PLCL/P123)共培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程皮膚，用以研究其是否加速大鼠創(chuàng)面愈合，并且擬

4、進(jìn)一步探討靜電紡納米支架材料其促脂肪干細(xì)胞分化、增殖等相關(guān)分子機制。
　　材料與方法：
　　（一）脂肪干細(xì)胞分離、鑒定、培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化
　　1)自SD大鼠（6W齡，體重180g左右）的大鼠腹股溝切取脂肪組織，經(jīng)常規(guī)酶消化法提取脂肪干細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)、繪制生長曲線。
　　2)采用單克隆抗體標(biāo)記ADSCs，然后采用流式細(xì)胞儀測定干細(xì)胞表面標(biāo)志物:CD29、CD34、CD44、CD54、CD90等。
　　3)通

5、過誘導(dǎo)分化劑的誘導(dǎo)，將ADSCs誘導(dǎo)分化成脂、成骨和成表皮，通過油紅“O”染色、茜素紅染色和Von kussa染色、CK10免疫熒光染色了解干細(xì)胞成脂、成骨和成表皮情況。
　?。ǘ┚廴樗?聚己內(nèi)酯/泊洛沙姆(PLCL/P123)靜電紡納米支架的制備及其特性鑒定
　　1)通過日本產(chǎn)靜電紡機器，制備四種不同配比的PLCL/P123靜電紡納米支架(75∶25、85∶15、90∶10、95∶5)。
　　2)采用掃描電鏡觀察不

6、同配比的混紡的PLCL/P123靜電紡納米支架的纖維形態(tài)和直徑大小。
　　3)采用SANS拉伸儀測定不同配比的PLCL/P123靜電紡納米支架的力學(xué)特性。
　　4)在光學(xué)顯微鏡下測定PLCL以及不同配比的PLCL/P123靜電紡納米支架的水接觸角。
　?。ㄈ┲靖杉?xì)胞與PLCL/P123靜電紡納米材料體外培養(yǎng)和生物學(xué)活性的研究
　　1)本組實驗共分6組:包括普通細(xì)胞培養(yǎng)皿平板組（對照組）、單純PLCL組、75∶

7、25、85∶15、90∶10、95∶5配比的PLCL/P123靜電紡納米材料組。
　　2)將細(xì)胞濃度為5×104/ml的ADSCs與以上6組材料在體外共同培養(yǎng)，電鏡下觀察ADSCs的生長情況。
　　3)將細(xì)胞濃度為2×105/ml的ASDCs與6組材料體外共培養(yǎng)，將共培養(yǎng)后的第1、3、7、10d的培養(yǎng)液收集，用RT-PCR法檢測其Ki67的表達(dá)量。
　　4)將ADSCs在PLCL/P123納米支架共同培養(yǎng)2d后，換表皮

8、誘導(dǎo)劑共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)15d后用CK10免疫熒光染色，激光共聚焦電鏡下觀察成表皮情況。
　?。ㄋ模┲靖杉?xì)胞與PLCL/P123靜電紡納米材料構(gòu)建組織工程皮膚對大鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)的研究
　　1)本組共采用SD大鼠8W齡，體重250g左右，12只分三組，包括A組:實驗組覆蓋創(chuàng)面采用ADSCs與PLCL/P123構(gòu)建的組織工程皮膚組;B組:實驗組覆蓋創(chuàng)面采用無細(xì)胞的PLCL/P123納米支架組;C組:對照組，創(chuàng)面覆蓋采用凡士林紗布組

9、。
　　2)在8W齡的SD大鼠背部各切除兩個直徑為1.5cm大小的全層皮膚缺損創(chuàng)面，分左右兩側(cè)，間隔2cm。然后以A組-B組;A組-C組;B組-C組在大鼠背部兩側(cè)作對照，肉眼觀察大鼠背部創(chuàng)面愈合的情況并作比較。
　　3)切除21d的大鼠背部創(chuàng)面組織，直徑1.5cm，分別作HE染色、CK10免疫組化和免疫熒光染色，CD31免疫組化染色，組織學(xué)了解大鼠背部創(chuàng)面愈合的情況。
　　結(jié)果：
　　1.自SD大鼠腹股溝切取脂肪

10、，經(jīng)常規(guī)酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞，具有干細(xì)胞的形態(tài)和特性，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志物的表達(dá)為CD29，CD44，CD54，CD90呈陽性表達(dá)，陽性率分別為95％，97％，88％，94％，而CD34表達(dá)呈陰性表達(dá)(0％);經(jīng)定向誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)ADSCs具有成脂、成骨、成表皮多向分化的潛能。
　　2.通過掃描電鏡顯示，經(jīng)靜電紡技術(shù)制備的PLCL/P123納米支架材料具有較好的纖維直徑，其拉伸模量、拉伸強度與正常皮膚接近;PLCL材料的

11、接觸角為131.5±8.9°，75∶25、85∶15、90∶10三組的水接觸角為0°，而95∶5組水接觸角為7.8±2.7°，表明純PLCL的親水性差，而加入P123共混共紡后，可以顯著提高材料的親水性能，有利于水對材料的浸潤。PH值測定提示支架材料均為酸性，但85∶15、90∶10、95∶5相對酸性較弱。
　　3.ADSCs在普通細(xì)胞培養(yǎng)皿平板組（對照組）、單純PLCL組、四種75∶25、85∶15、90∶10、95∶5配比的P

12、LCL/P123靜電紡納米材料上共培養(yǎng)，激光共聚焦電鏡和Ki67檢測均發(fā)現(xiàn)ADSCs在PLCL/P123靜電紡納米材料上增殖生長明顯優(yōu)于對照組和純PLCL組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。
　　4.采用A組（ADSCs與PLCL/P123構(gòu)建的組織工程皮膚組）比無B組和C組創(chuàng)面愈合快;B組（無細(xì)胞PLCL/P123納米支架組）比對照組愈合快。創(chuàng)面愈合率三組差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。
　　5.HE染色提示A組的創(chuàng)面

13、組織接近正常皮膚，CK10染色發(fā)現(xiàn)陽性，B組的 HE染色表皮結(jié)構(gòu)不完整，CK10染色發(fā)現(xiàn)少量陽性表達(dá)，C組未見表皮結(jié)構(gòu)，CK10陰性表達(dá)。經(jīng)免疫熒光染色檢測，A組創(chuàng)面愈合的皮膚可見到經(jīng)標(biāo)記的ASDCs成為表皮樣細(xì)胞，皮下可見到大量新生的微小血管，其微小血管密度明顯大于B組和C組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1.脂肪干細(xì)胞(ADSCs)分離培養(yǎng)簡單，容易獲取，其干性強，傳代穩(wěn)定，具有多向分化的潛能。