再障兒童造血干細(xì)胞因子受體mRNA表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是血液系統(tǒng)常見的疾病，是多種原因引起的造血功能障礙，其發(fā)病原因極為復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今未完全清楚。在再障患者骨髓中，各種類型的造血干/祖細(xì)胞均明顯減少或缺如；患者造血衰竭的程度與骨髓中造血細(xì)胞的數(shù)量成正比；并且在再障患者骨髓涂片中，造血細(xì)胞比率明顯減少、非造血細(xì)胞比率明顯增多及在骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)中，無論紅系、還是粒系集落數(shù)明顯減少，均提示造血干細(xì)胞缺乏導(dǎo)致造血功能衰竭可能是再障發(fā)病的

2、主要因素。干細(xì)胞因子(SCF)及其受體C-KIT，廣泛的分布于各種發(fā)育階段的造血細(xì)胞及其他_些組織中，調(diào)控著干細(xì)胞的分化及成熟。自SCF及其受體C-KIT發(fā)現(xiàn)以來，人們就想到二者同再生障礙性貧血是否存在著聯(lián)系。近年來研究表明C-KIT基因的異常涉及許多疾病的發(fā)生，尤其在一些血液疾病和惡性腫瘤中，出現(xiàn)了基因的表達(dá)異常和結(jié)構(gòu)的突變，較高的突變位點(diǎn)集中在外顯子9、11、13，并且在一些腫瘤細(xì)胞中，表現(xiàn)了不止一個(gè)部位的基因變異。由此提示我們在兒

3、童再障的發(fā)病中，是否也存在著C-KIT的表達(dá)和結(jié)構(gòu)異常? 目的：通過研究再生障礙型貧血兒童中造血干細(xì)胞因子受體C-KITmRNA的表達(dá)和C-KIT基因Exon 9、11、13結(jié)構(gòu)是否存在著突變，以探討其在兒童再生障礙性貧血發(fā)病中的作用。 材料與方法：采集2005年07月至2006年02月期間，鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科經(jīng)骨髓確診的再生障礙性貧血患兒抗凝骨髓共15例為實(shí)驗(yàn)組，其中男6例，女9例，年齡

4、2．5～13歲，中位年齡6歲；正常兒童骨髓15例為對(duì)照組，男7例，女8例，年齡2～13歲，中位年齡6．5歲，為隨機(jī)選擇的在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院排除惡性血液疾病的兒童，二者年齡、性別構(gòu)成沒有差異。結(jié)合C-KIT基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，我們選擇了有代表性的三個(gè)位點(diǎn)，即編碼細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)域的C-KIT外顯子9基因、編碼并膜結(jié)構(gòu)域的C-KIT外顯子11基因、編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的C-KIT外顯子13基因?yàn)闄z測對(duì)象。根據(jù)美國國立醫(yī)學(xué)圖書館(National C

5、enter for Biotechnology Information，NCBI)核酸序列數(shù)據(jù)庫中C-KIT’基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出引物序列。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨髓標(biāo)本分別采用骨髓單個(gè)核細(xì)胞提取術(shù)提取單個(gè)核細(xì)胞后、應(yīng)用RNA提取試劑提取單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成eDNA；并通過特異引物用PCR方法擴(kuò)增C-KIT基因外顯子9、11、13；用瓊脂糖凝膠電泳和凝膠圖象系統(tǒng)對(duì)進(jìn)行產(chǎn)物分析，比較正常兒童骨髓與再障兒童C

6、-KIT外顯子9、11、13產(chǎn)物有無表達(dá)的差異；對(duì)C-KIT外顯子9、11、13陽性表達(dá)的正常兒童和再障標(biāo)本，再次進(jìn)行SSCP(單鏈多態(tài)構(gòu)象分析)以期發(fā)現(xiàn)有無結(jié)構(gòu)的改變；對(duì)C-KIT基因外顯子9、11、13 PCR產(chǎn)物提純后進(jìn)行序列分析測定，比較再障患兒與正常兒童C-KIT的有無突變位點(diǎn)。 結(jié)果：①經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠圖象系統(tǒng)分析后，發(fā)現(xiàn)再障患兒與正常兒童c-KIT基因Exon 9、11、13 mRNA的表達(dá)二者間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義(P>0.05)；②經(jīng)過單鏈多態(tài)構(gòu)象分析發(fā)現(xiàn)，再障患兒C-KIT基因Exon 9、11、13的堿基序列與正常對(duì)照兒童相比無差異；③基因序列測定與Genebank中的基因圖譜進(jìn)行比對(duì)，Exon 9、11、13均未見堿基序列改變或堿基數(shù)目的增多、缺失等情況存在，說明了該基因結(jié)構(gòu)沒有改變。 結(jié)論：瓊脂糖凝膠電泳和凝膠圖象系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)再障患兒與正常兒童C-KIT基因Exon 9、1 1、13 mRNA的表達(dá)沒有差異；單鏈多態(tài)構(gòu)象分析未

8、發(fā)現(xiàn)再障患兒C-KIT基因Exon 9、1 1、13的堿基序列異常；基因序列測定未見再障患兒C-KIT基因Exon 9、11、13堿基序列改變；這些說明①C-KIT受體在再障兒童的骨髓造血細(xì)胞中的數(shù)量分布正常，并且其mRNA表達(dá)水平不降低；②C-KIT受體在再障兒童基因結(jié)構(gòu)沒有改變，未見堿基序列改變或堿基數(shù)目的增多、缺失等情況；⑨再障兒童SCF/C-KFT信號(hào)系統(tǒng)的異常中，C-KIT起了非關(guān)鍵的作用；SCF在其中可能起到主要的作用；④再