HB-EGF和谷氨酰胺對壞死性小腸結(jié)腸炎新生大鼠線粒體途徑細(xì)胞凋亡及炎癥因子的影響.pdf

1、研究背景：
　　新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（Neonatal Necrotizing Enterocolitis，NEC）是新生兒常見的危重癥，目前其病因及具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。其高危因素包括早產(chǎn)、腸道不成熟、缺氧缺血、人工喂養(yǎng)、細(xì)菌移位等。在這些高危因素下，促炎因子釋放、腸道炎癥級聯(lián)反應(yīng)及機(jī)體各種調(diào)節(jié)機(jī)制的失衡等綜合作用，最終導(dǎo)致NEC的發(fā)生發(fā)展。NEC病例病情的嚴(yán)重程度不等，有的病例僅為短期的喂養(yǎng)不耐受，而有的則迅速出現(xiàn)小腸、

2、結(jié)腸廣泛壞死；嚴(yán)重的病例約半數(shù)需要手術(shù)治療，并且經(jīng)手術(shù)治療的病例遠(yuǎn)期可能存在神經(jīng)生長發(fā)育遲緩等后遺癥。因此，臨床上采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施來預(yù)防NEC的發(fā)生具有重要意義。目前，國內(nèi)外已開展較多這方面的研究，如有研究表明表皮生長因子及谷氨酰胺可預(yù)防NEC發(fā)生及改善NEC病情；但是現(xiàn)有的研究多限于動物實(shí)驗(yàn)，其具體作用機(jī)制亦不明確，并且目前暫無充分的統(tǒng)計(jì)學(xué)上支持的臨床使用依據(jù)。因此進(jìn)一步闡明表皮生長因子及谷氨酰胺對損傷腸道保護(hù)作用的機(jī)制，對防治NE

3、C具有十分重要的意義。
　　細(xì)胞凋亡在NEC病理生理改變中具有重要的作用。細(xì)胞凋亡有兩條主要的凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，分別是死亡受體途徑和線粒體途徑。NEC引起氧化應(yīng)激時(shí)腸道凋亡信號的主要來源是線粒體。線粒體途徑有胱解酶（Caspase）依賴性和非依賴性兩種方式。在胱解酶依賴性線粒體途徑中，細(xì)胞色素C由線粒體釋放并與凋亡肽酶激活因子（Apoptotic pr otease activating factor1，APAF-1）結(jié)合激活胱解酶（

4、Caspase）級聯(lián)反應(yīng)是關(guān)鍵步驟；而不依賴Caspase的線粒體途徑細(xì)胞凋亡機(jī)制中，凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis inducing fact or，AIF），核酸內(nèi)切酶G（Endonuclease G）等是關(guān)鍵性促凋亡因子。大量研究表明，各種高危因素下，腸道組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及線粒體途徑細(xì)胞凋亡的活化等共同參與NEC的發(fā)生發(fā)展，并最終導(dǎo)致腸道損傷。因此，線粒體途徑細(xì)胞凋亡信號通路可能作為干預(yù)靶點(diǎn)或干預(yù)措施的效應(yīng)器而影響N

5、EC的病程。
　　肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）是表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）家族成員之一，它通過與表皮生長因子受體（EGF-R）相結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明，HB-EGF能增加腸道微血管血流，促進(jìn)血管發(fā)生；保護(hù)腸道干細(xì)胞，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞移居及增殖；減

6、少腸道細(xì)菌移位，保護(hù)腸道屏障功能；下調(diào)粘附分子的表達(dá)和炎癥細(xì)胞浸潤以及減少腸道細(xì)胞凋亡從而起到保護(hù)腸道的作用。動物實(shí)驗(yàn)表明，EGF和HB-EGF均能顯著降低NEC的發(fā)生率并改善NEC模型新生大鼠腸道損傷程度。另有研究表明，予IGF-1及EGF干預(yù)后，大鼠腸上皮細(xì)胞株對活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的凋亡活化信號減弱；而在人類胎兒腸上皮細(xì)胞株中，聯(lián)合予 IGF-1及 EGF可減弱線粒體途徑細(xì)胞凋亡信號

7、而具有抗凋亡作用。因此，HB-EGF亦有可能通過調(diào)節(jié)線粒體途徑細(xì)胞凋亡通路而在腸上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。
　　谷氨酰胺（glutamine，Gln）是人體內(nèi)含量最多的條件必須氨基酸，是一種高效能量物質(zhì)，為體內(nèi)合成嘌呤、嘧啶及核苷酸提供氮的前體，參與體內(nèi)酸堿平衡調(diào)節(jié)，運(yùn)送氮源，也是氮源的提供體，是腸道粘膜細(xì)胞及各種快速生長細(xì)胞（如腎小管細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的代謝氧化燃料，被稱為組織特需營養(yǎng)物。與肝臟或骨骼

8、肌相比，腸上皮細(xì)胞內(nèi)Gln池儲量很小，明顯依賴于外源性Gln的供給。在疾病、營養(yǎng)狀態(tài)不佳或高強(qiáng)度運(yùn)動等應(yīng)激狀態(tài)下，Gln可以通過降低腸粘膜通透性和減少菌群移位來增強(qiáng)腸道免疫力、阻止腸粘膜細(xì)胞凋亡等而起到保護(hù)腸道的作用。
　　另外，炎癥級聯(lián)反應(yīng)是NEC病理生理改變的核心環(huán)節(jié)，研究表明，NEC病程中升高的炎癥因子、促炎因子和抗炎因子的失衡在 NEC中發(fā)揮重要作用。動物實(shí)驗(yàn)表明，在新生大鼠NEC中，促炎因子IL-12、IL-18與組織損

9、害嚴(yán)重程度成正相關(guān)。
　　鑒于此，我們推測，HB-EGF和Gln可能影響線粒體途徑細(xì)胞凋亡通路，改善NEC模型新生大鼠損傷腸道的形態(tài)學(xué)及降低炎癥水平，從而降低NEC發(fā)生率、改善NEC病程及預(yù)后。但是HB-EGF和谷氨酰胺在線粒體途徑細(xì)胞凋亡中的作用國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立NEC新生大鼠模型，予HB-EGF和Gln干預(yù)，觀察腸道損傷的變化、檢測線粒體途徑細(xì)胞凋亡通路相關(guān)因子及相關(guān)促炎因子，以進(jìn)一步闡明HB-EGF和Gln對N

10、EC模型新生大鼠腸道損傷保護(hù)作用的機(jī)制。
　　目的：
　　1.建立新生大鼠 NEC模型，探討HB-EGF在壞死性小腸結(jié)腸炎線粒體途徑細(xì)胞凋亡中的作用，為HB-EGF在NEC中的抗凋亡作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2.探討谷氨酰胺在壞死性小腸結(jié)腸炎線粒體途徑細(xì)胞凋亡中的作用，為谷氨酰胺抗腸道細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　3.測定NEC新生大鼠回腸中IL-12及IL-18蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步闡述谷氨酰胺、H

11、B-EGF對NEC新生大鼠促炎癥因子的影響。
　　方法：
　　1.新生大鼠NEC模型的建立：乳鼠娩出后即與母鼠分離，生后即開始代乳品人工喂養(yǎng)；并每天予缺氧90秒、4℃冷刺激10min，每天2次，連續(xù)3天。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：新生大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D四組，每組各10只。A組（模型組）：予代乳品人工喂養(yǎng)，并定期給予缺氧冷刺激；B組（HB-EGF干預(yù)組）：予代乳品人工喂養(yǎng)，定期給予缺氧冷刺激，并予HB-EGF與配方奶一

12、起灌胃，800μg/kg/次，每天4次，連續(xù)3天；C組（對照組）：予鼠乳喂養(yǎng)；D組（Glu干預(yù)組）：代乳品人工喂養(yǎng)，定期給予缺氧冷刺激，并予谷氨酰胺與配方奶一起灌胃，0.3g/次，每天6次，連續(xù)3天。
　　3.干預(yù)結(jié)束后12h（對照組與模型組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)）取回腸組織，光鏡觀察各組病理改變；電鏡觀察回腸組織腸上皮與肌層細(xì)胞線粒體改變。
　　4.免疫組織化學(xué)方法檢測細(xì)胞色素C
　　5. Western-Blot檢測線粒體凋

13、亡通路中AIF、APAF-1表達(dá)情況。
　　6. ELISA法檢測回腸組織勻漿上清中IL-12、IL-18水平，觀察各組炎癥反應(yīng)情況。
　　7.采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x s±）表示。計(jì)數(shù)資料以率表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)的兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　結(jié)果：
　　1.HB-EGF在新生鼠NEC線粒體途徑細(xì)胞凋亡中的作用
　

14、　1.1 NEC模型組（A組）NEC發(fā)生率為90％。HB-EGF干預(yù)組（B組）NEC發(fā)生率為20%。正常對照組（C組）NEC發(fā)生率為0。NEC發(fā)生率A組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組比較，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　1.2電鏡下 A組回腸腸上皮細(xì)胞及肌層細(xì)胞中線粒體明顯腫脹，基質(zhì)內(nèi)有多數(shù)電子透亮區(qū)；C組中線粒體超微結(jié)構(gòu)正常；B組中有少量線粒體腫脹，較之A組病變明顯減輕。
　　1.3細(xì)

15、胞色素C的表達(dá)A組與C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，前者高于后者（P＜0.05）。細(xì)胞色素C在B組中亦有大量表達(dá)，B組與A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　1.4 APAF-1、AIF的表達(dá)A組與C組比較，前者高于后者。與A組相比，B組APAF-1的表達(dá)減低，AIF的表達(dá)則明顯增強(qiáng)。
　　2.谷氨酰胺在新生鼠NEC線粒體凋亡中的作用
　　2.1谷氨酰胺干預(yù)組（D組）NEC發(fā)生率為40%。NEC發(fā)生率D組與A

16、組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組低于A組（P＜0.05）。
　　2.2電鏡下D組回腸上皮及肌層中有少量線粒體腫脹，較之A組病變明顯減輕。
　　2.3細(xì)胞色素C的表達(dá)D組與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D組較A組減弱（P＜0.05）。
　　2.4與A組比較，D組APAF-1的表達(dá)減弱，AIF的表達(dá)增強(qiáng)。
　　3.HB-EGF和谷氨酰胺在新生鼠NEC中對IL-12和IL-18的影響
　　3.1與C組相比，回腸組織I

17、L-12水平在A組明顯增加；B組和D組分別與A組比較，IL-12表達(dá)水平均減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.2與C組相比，回腸組織IL-18在A組明顯增加；B組和D組分別與A組比較，IL-18表達(dá)水平均減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. HB-EGF可減少NEC模型新生大鼠腸道細(xì)胞凋亡，但僅能抑制部分凋亡蛋白因子，該作用可能是通過調(diào)節(jié)線粒體途徑細(xì)胞凋亡因子而間接干預(yù)線粒體