ERCC1基因及其多態(tài)性與草酸鉑治療進展期腸癌的相關研究.pdf

1、本研究首先比較ERCC1在術中取材的大腸腫瘤組織及標準化腸癌細胞系中表達水平與草酸鉑敏感性的關聯(lián)，并以中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)野生型AA8和ERCC1表達缺失型UV20作為細胞對照模型，根據(jù)所建立的評價草酸鉑細胞毒性及DNA損傷修復的實驗方法，系統(tǒng)研究了草酸鉑細胞毒性機制。另外，利用Gateway定向克隆技術構建兩種包含ERCC1 codon 118 SNP不同基因型的表達載體，分別轉染ERCC1表達缺失型CHO細胞UV20，獲得穩(wěn)

2、定轉染細胞系后，比較ERCC1 codon 118 SNP不同基因型對ERCC1蛋白表達水平、細胞DNA損傷修復能力及對草酸鉑敏感性的影響。本研究旨在探尋草酸鉑治療進展期大腸癌的分子標志物，以達到選擇合理優(yōu)化藥物治療方案，提高草酸鉑使用的安全性及有效性的目的。另外，本研究有別于以往相關研究單純注重臨床病例資料生存分析的方法，多角度地系統(tǒng)闡明草酸鉑的細胞毒作用機制。Gateway定向克隆技術構建包含不同ERCC1 SNP表達載體，獲得穩(wěn)定

3、轉染細胞系，提供體外研究DNA損傷修復基因遺傳多態(tài)性的一個實驗技術平臺，打開了一種解決棘手的抗腫瘤藥物耐藥性問題的全新思路，無疑對相關領域研究具有重要的理論意義和實際價值。 研究方法： 一、材料。 1、大腸癌組織標本來源與處理。術中取直徑約為2cm以上的新鮮大腸癌組織，切開為兩部分。一部分立刻進行原代細胞培養(yǎng)；另外一部分保存于液氮中，保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r記錄患者性別、年齡、臨床分期、病理類型等一般自然情況。 2

4、、腫瘤組織原代細胞培養(yǎng)。術中切除的腫瘤組織，碘氟消毒后，用含適量雙抗液的生理鹽水常規(guī)制成單細胞懸液。含10％小牛血清的RPMI-1640液調整細胞濃度后，種植于無菌96孔細胞培養(yǎng)板上。CO<,2>細胞培養(yǎng)箱孵育24h后，無污染，細胞貼壁者為培養(yǎng)成功細胞。 3、細胞系及細胞培養(yǎng)。五種腸癌細胞系：LOVO、COLO320、HCT81、DLD-1、SW48和中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)：AA8、UV20。含青霉素鉀10萬單位/L，硫酸

5、鏈霉素0.1g/L，5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。 4、Gateway定向克隆技術構建的ERCC1表達載體。整個過程大致分為以下兩步：一是創(chuàng)建Gateway入門克?。焊鶕?jù)λ嗜菌體位點B P特異重組獲得包含ERCC1目的基因的載體pDONR201-ERCC1(C/C或T/T)，Pst Ⅰ酶切鑒定，PSQ分析儀鑒別ERCC1基因型。二是將包含ERCC1目的基因的入門克隆pDONR201-E

6、RCC1，plRES-GFP300ng共同孵育，通過LR結合反應產生表達克隆plRES-GFP-ERCCI(C/C或T/T)。HindⅢ、BglⅡ酶切鑒定并測序。 二、實驗方法： 1、腫瘤組織、各細胞系總RNA提取及逆轉錄合成cDNA。TRIZOL試劑或β-Mercaptoethanol溶解細胞，異丙醇法提取總RNA。 cDNA合成總反應體系20μl中RNA含量為1μg，總反應體系中包括5×逆轉錄緩沖液、四種dN

7、TP混合液、隨機引物、RNase Inhibator、AMV反轉錄酶。 2、腫瘤組織及各細胞系ERCC1 mRNA水平測定。逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增腫瘤組織cDNA的ERCC1目的片段(894bp)。瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，紫外燈下拍照，與β-actin對比后，根據(jù)灰度值比較大腸癌組織ERCC1mRNA表達情況。 7500 Taqman Real-Time PCR反應儀檢測各腸癌細胞系、CHO細胞的ERCC1

8、mRNA水平(探針法)和內參考基因GAPDH mRNA水平(SYBR green法)。計算Log10 ERCC1△CT。 3、CHO細胞、轉染細胞蛋白提取及Westemblot檢測ERCC1蛋白表達。凍融法提取蛋白。離心后收獲蛋白上清。Coomassie蛋白定量法測定蛋白濃度。聚丙稀凝膠電泳法-Westemblot檢測ERCC1蛋白表達。 一抗：山羊抗人ERCCl稀釋濃度1：1000；4℃孵育過夜。 二抗：HRP

9、標記驢抗山羊IgG稀釋濃度1：10000。常規(guī)進行轉膜、雜交、ECL反應、曝光及洗片。同時設立僅有二抗的陰性對照，以證明實驗結果的特異性。 4、DNA短序列分析鑒定ERCC1 SNP基因型。PCR．擴增包含ERCC1 codon 118 SNP一段80bp基因片段，根據(jù)實驗要求及操作指南上樣于PSQ分析儀，測定ERCCl codon118 SNP基因型。SQA 96 MA軟件分析源于不同cDNA的ERCC1 SNP基因型。

10、 5、草酸鉑的細胞抑制率測定。根據(jù)實驗要求將不同種類細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板16-24h細胞貼壁后，0～2×10<'5>nM濃度范圍草酸鉑染毒24h，更換培養(yǎng)液，另培養(yǎng)72h。MTT法測定草酸鉑對大腸癌組織原代培養(yǎng)細胞抑制率，并計算IC<,50>。SRB法測定草酸鉑對腸癌細胞系、CHO細胞抑制率，并計算IC<,50>。 6、改良彗星實驗檢測草酸鉑所致DNA損傷。根據(jù)實驗要求將不同種類細胞接種6孔培養(yǎng)板16-24h細胞貼壁后，

11、 195、3125nM草酸鉑染毒1h，棄培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，24h。30μM H<,2>O<,2>誘導單鏈DNA斷裂后收獲細胞。經制片、裂解、解旋、電泳、中和、EB染色，熒光顯微鏡下拍照評分。 研究結果： 1、逆轉錄PCR測定大腸腫瘤組織中的ERCClmRNA水平與腫瘤原代培養(yǎng)細胞的草酸鉑IC<,50>呈正相關關系。(Spearman等級相關分析，相關系數(shù)r<,s>=0.711，P=0.032)。 實時．定量P

12、CR分析腸癌細胞系中的ERCC1mRNA水平，與相應草酸鉑IC<,50>呈正相關關系。Pearson相關分析表明，無論草酸鉑處理前后，IC<,50>與ERCC1mRNA水平呈正相關(處理前：r=0.910，P=0.032；處理后：r=0.907,P=0.037)，可見，無論對于大腸癌組織還是腸癌細胞系，隨著ERCC1表達水平的升高，腫瘤細胞對草酸鉑的敏感性降低。 2、實時．定量PCR測定195nM草酸鉑處理前后各腸癌細胞ERCC

13、1mRNA水平，結果顯示各腸癌細胞草酸鉑處理前后ERCC1mRNA水平并無明顯改變。 3、彗星實驗反應ERCC1對草酸鉑所致DNA損傷及損傷修復能力的影響。AA8抑或UV20均隨著草酸鉑濃度增加，DNA損傷程度趨于嚴重。相對于AA8而言，無論195還是3125nM，UV20都表現(xiàn)出較重的DNA損傷。AA8在草酸鉑處理后6h產生的DNA損傷，在24h時由于完善的DNA修復系統(tǒng)而得到部分修復。而ERCC1表達缺失的UV20，卻無明顯

14、的損傷修復能力。 4、AA8、UV20在不同濃度草酸鉑處理后6h、24h時點上，分別進行Rad51免疫熒光實驗。UV20在3125nM草酸鉑處理后24h，DNA損傷斷裂比AA8更加明顯。 5、包含ERCCl入門載體pDONR-ERCC1(3150bp)轉化大腸桿菌(E．coli DH5α)，可選擇生長于含1％卡那霉素培養(yǎng)基平板，質粒純化后，用Pst Ⅰ進行限制性酶切，得到533 bp和2617 bp的預期片段。

15、6、plRES。GFP．ERCC1(C/C)及plRES-GFP-ERCC1(T/T)質粒轉染UV20細胞，同時轉染pIRES-GFP質粒做為空對照質粒。轉染細胞可在含10％G418的DMEM培養(yǎng)基選擇生長，次日調G418濃度為5％，五日后，熒光顯微鏡下可見表達綠色熒光蛋白的轉染細胞，轉染效率達85％以上。 7、Westemblot鑒定ERCC1基因在各細胞中的表達，分別于UV20-ERCC1(C/C)或UV20-ERCC1(T

16、/T)細胞可表達分子量為38kDa的ERCC1蛋白，進一步證實細胞轉染成功。 8、PSQ<'TM>96MA分析儀驗證不同細胞的ERCC1 SNPs：兩種轉染細胞UV20-ERCC1(C/C)或UV20-ERCC1(T/T)ERCC1 SNP基因型不同，分別為C或T。 研究結論： 1、草酸鉑藥物抗性與大腸癌組織或腸癌細胞系中固有的ERCC1蛋白表達水平呈正向相關關系，核苷酸切除交叉互補集團1基因(ERCC1)mRN

17、A水平可以作為草酸鉑治療腸癌預后預測的一個遺傳標記。 2、草酸鉑以一種DNA內交聯(lián)劑形式，與DNA雙鏈相互作用形成DACH-Pt-DNA加合物，阻止DNA復制，導致細胞損傷。細胞本身的DNA損傷修復能力與草酸鉑敏感性密切相關，而ERCC1蛋白在草酸鉑所致的DNA損傷修復中起到關鍵的切除修復作用。 3、Gateway定向克隆技術成功構建包含不同ERCC1 codon 118 SNPs基因型的表達載體，并獲得穩(wěn)定轉染細胞系，