含Rolipram的新型納米纖維支架和NSCs移植對顱神經(jīng)損傷后的治療作用的研究.pdf

1、第一部分：NSCs的培養(yǎng)、鑒定及GFP標(biāo)記
　　目的：分離、培養(yǎng)和純化大鼠成體NSCs。構(gòu)建表達(dá)GFP的慢病毒載體對NSCs進(jìn)行GFP標(biāo)記。
　　方法：應(yīng)用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)并純化從大鼠胎鼠海馬分離得到的細(xì)胞，通過有限稀釋法驗證其具有自我增殖的能力，通過免疫熒光染色標(biāo)記驗證其能否分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，四種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后收集富含慢病

2、毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心純化成不同濃度的濃縮病毒，再轉(zhuǎn)染NSCs。
　　結(jié)果：可以應(yīng)用無血清培養(yǎng)液從大鼠胎鼠海馬培養(yǎng)并純化NSCs，其在體外具有自我增殖和分化的能力?？梢酝ㄟ^慢病毒載體介導(dǎo)對NSCs進(jìn)行GFP標(biāo)記。
　　結(jié)論：應(yīng)用無血清培養(yǎng)液自大鼠胎鼠海馬內(nèi)成功分離培養(yǎng)出NSCs。慢病毒載體介導(dǎo)的GFP可對NSCs進(jìn)行有效標(biāo)記。
　　第二部分：Rolipram對NSCs體外培養(yǎng)的藥物濃度篩選
　　

3、目的：在體外培養(yǎng)情況下，了解不同濃度Rolipram對NSCs活性的影響，并篩選其可促進(jìn)神經(jīng)元突起生長的最適濃度。
　　方法：將NSCs放在含不同濃度Rolipram的NSCs培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過CCK-8法連續(xù)測定不同時間的OD450值，了解不同濃度Rolipram對NSCs活性的影響；將NSCs在含不同濃度Rolipram的NSCs分化液中培養(yǎng)，通過測定NSCs分化后的神經(jīng)元軸突長度，選擇合適的Rolipram濃度。
　　

4、結(jié)果：不同濃度的Rolipram對NSCs體外培養(yǎng)的細(xì)胞活性均有一定的影響：NSCs在含0.25μM濃度Rolipram的分化液中體外培養(yǎng)的神經(jīng)元突起長度最長。
　　結(jié)論：在體外培養(yǎng)情況下，0.25μM濃度的Rolipram對NSCs活性影響最小，對神經(jīng)元突起生長促進(jìn)作用最明顯。
　　第三部分：NSCs、Rolipram與PLGA納米纖維支架聯(lián)合移植治療SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損
　　目的：探討聯(lián)合應(yīng)用NSCs、Rolipr

5、am與PLGA納米纖維支架移植治療SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損的效果。
　　方法：建立sD大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型，移植不同的組織工程神經(jīng)支架，12周后通過行為學(xué)觀察、神經(jīng)電生理測定，組織學(xué)及免疫組化標(biāo)記等了解其對周圍神經(jīng)再生的作用。
　　結(jié)果：不同組合的組織工程神經(jīng)支架均可以使SD大鼠的坐骨神經(jīng)缺損損傷后再生：
　　1.含Rolipram的PLGA納米纖維支架和NSCs聯(lián)合移植治療SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損傷效果優(yōu)于單純支架，支架+R

6、olipram/NSOs組(p<0.05)；
　　2.PLGA支架+Rolipram/NSCs組優(yōu)于單純PLGA支架組(p<0.05)；
　　3.PLGA支架+Rolipram與PLGA支架+NSCs組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。
　　結(jié)論：PLGA納米纖維支架與NSCs、Rolipram聯(lián)合應(yīng)用移植治療SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損的效果好于其單獨應(yīng)用。
　　第四部分：NSCs、Rolipram與PLGA納米纖維支

7、架聯(lián)合移植治療獼猴面神經(jīng)缺損初步結(jié)果
　　目的：進(jìn)一步驗證聯(lián)合應(yīng)用NSCs、Rolipram與PLGA納米纖維支架移植治療獼猴面神經(jīng)神經(jīng)缺損的效果。
　　方法：建立獼猴面神經(jīng)缺損模型，移植不同的組織工程神經(jīng)支架，12周后通過行為學(xué)觀察、神經(jīng)電生理測定，組織學(xué)及免疫組化標(biāo)記等了解其對顱神經(jīng)再生的作用。
　　結(jié)果：不同組合的組織工程神經(jīng)支架均可以使獼猴面神經(jīng)缺損損傷后再生，三者聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)功能恢復(fù)得最快。
　　結(jié)論：