人CD81特異性siRNA的篩選、高效表達體系的構建及抗HCV感染的功能性分析.pdf

1、隨著RNA干擾(RNA interference,RNAi)概念的提出及相應技術推廣應用,人們對預防HCV感染的思路得以拓寬。以RNAi為主線,研究者們通過多種途徑提高RNA干擾的效率及穩(wěn)定性。長期以來,因為缺乏適合的細胞培養(yǎng)體系和動物模型,HCV的研究較為緩慢。HCVcc(cell cultured HCV virus,HCVcc)及HCVpp(HCV infectious pseudotype particles,HCVpp)的成功

2、構建,為HCV的研究提供了體外平臺,這大大促進了HCV感染機制的研究步伐,為我們開辟了一個嶄新的時代。 RNA干擾技術是近年來產生的新興生物技術。RNAi作用的基本原理是雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)結合核酶復合物形成RNA誘導的沉默復合體(RISC),激活的RISC通過過堿基配對定位到同源mRNA轉錄體上并切割mRNA,進而破壞特定目的基因轉錄產生的mRNA,使其功能沉默。由于siR

3、NA作用的階段是在目的基因轉錄成為mRNA以后,即轉錄后,所以RNAi引導的基因沉默又稱轉錄后基因沉默(PTGS)。 HCV基因組是一條長約9.6kb的正鏈RNA,包括5'非編碼區(qū)(5'NTR)、開放讀碼框架(ORF)以及3'非編碼區(qū)(3'NTR)。由于其本身就是RNA,所以HCV天生就是基于RNAi治療的合適對象。 單從RNA干擾的角度,可以從兩個方面阻斷HCV的感染。其一是尋找篩選靶向于HCV基因組本身的RNAi序列,抑制H

4、CV在細胞內的復制。其二是選擇靶向于HCV易感細胞HCV入侵感染相關因子的RNAi序列,干擾HCV與靶細胞結合、穿入、復制等多個層面,達到抗病毒的目的。然而,HCV的高度變異性使得針對于HCV基因組本身的RNAi很難發(fā)揮持久有效的作用。于是,人們把目光轉移到對HCV入侵復制相關因子的干擾上來。 CD81分子屬于四跨膜蛋白(tetraspanin)超家族成員,又稱TAPA-1,是跨膜四次、分子量為26 kD的細胞表面非糖基化蛋白,

5、該分子在各種細胞上有廣泛表達。已有的研究表明,CD81與HCV包膜蛋白E2的相互識別是介導HCV入胞的重要事件,CD81也因此作為HCV最重要的候選受體而倍受關注。在該部分論文中,我們主要以CD81作為靶分子,探討CD81的RNA干擾在抗HCV感染中的作用。 一.人CD81特異性siRNA的篩選及CD81穩(wěn)定干擾細胞株的構建 在本研究中,我們首先設計了6段分別針對CD81不同區(qū)域的siRNA序列,合成了相應的DNA模板,

6、通過體外轉錄及純化制備出了高純度siRNA產物。將制備的6種siRNA與本室構建的CD81-EGFP融合蛋白表達質粒電穿孔或者脂質體法共轉染人胚腎HEK 293T細胞,轉染72h后,熒光顯微鏡觀察各siRNA轉染細胞并行流式細胞術精確定量GFP(+)細胞數。同時,裂解部分細胞行Western blot檢測各siRNA轉染細胞CD81-EGFP融合蛋白的表達水平。抽提各siRNA轉染細胞總RaNA行FQ-PCR,檢測各樣品CD81 mRN

7、A水平。蛋白質水平及mRNA水平結果顯示,6段siRNA均發(fā)揮了作用,能夠抑制融合蛋白CD81-EGFP的表達,其中以靶向于CD81 3'NTR區(qū)的2段siRNA最為有效,分別使CD81-EGFP融合蛋白表達水平下降了84％和87％,mRNA水平下降了87％ 和90％。為進一步驗證6段siRNA對內源性CD81的抑制效應,我們在人肝癌細胞系Huh7.5細胞中進行了第二輪篩選,發(fā)現各siRNA對Huh7.5細胞內源性CD81的抑制

8、作用與HEK 293T細胞中的趨勢相同。我們選擇了6段siRNA中最有效的1段,構建shRNA表達質粒pGCsi-CD81,轉染Huh7.5細胞,以G418(300mg/L)篩選陽性克隆2-3周,挑選其中11個克隆擴大培養(yǎng),流式細胞術檢測各克隆CD81的表達水平,結果顯示各克隆CD81表達均有不同程度的下降。其中克隆C1下降最多,僅為原表達量的8％。將該克隆進一步擴大培養(yǎng),可作為CD81穩(wěn)定抑制的Huh7.5細胞株應用于抗HCV感染的功

9、能學分析。 二.CD81shRNA慢病毒表達載體的構建及干擾效果鑒定 質粒介導RNAi有轉染率低、基因表達抑制作用弱、持續(xù)時間短、不適合體內實驗等局限性。慢病毒載體是一種逆轉錄復制缺陷載體,以HIV-1為基礎發(fā)展而來,具有感染效率高、能感染非分裂期細胞和分裂期細胞、病毒的遺傳物質能整合入宿主的基因組、RNAi作用持久等許多優(yōu)點。因此,我們構建了CD81shRNA慢病毒表達載體以獲得更好的干擾效果。 以第一部分中構

10、建好的CD81shRNA表達質粒pGCsi-CD81為模板,PCR方法擴增出包括U6啟動子在內的CD81shRNA DNA序列,測序證實后,SnaBI＆SalI雙酶切、連接及轉化等步驟成功插入預先切除GFP基因片段的慢病毒表達載體pRRLsin.PPTs.hCMV.GFPpre中,命名為pLenti-shCD81。通過與輔助質粒共轉染HEK293T細胞,包裝出完整的慢病毒顆粒,感染Huh7.5細胞,體外傳代培養(yǎng)7-10d后,行流式細胞術

11、及FQ-PCR檢測感染細胞CD81蛋白質和mRNA水平。結果表明,Lenti-shCD81慢病毒感染細胞中的CD81表達被穩(wěn)定抑制,較之未感染細胞及陰性對照細胞,CD81表達下降了94％左右。隨后,我們收集不同感染天數的細胞重復檢測CD81的表達水平,得到的結果同第一次檢測結果大體一致。同時,為了確定慢病毒感染及CD81的抑制對細胞是否存在致病效應,我們通過為期1周的MTT實驗監(jiān)測了慢病毒感染Huh7.5細胞的生長增殖情況并繪制了生長曲

12、線圖。觀察發(fā)現,空白組、Lenti-shCD81感染組及其陰性對照Lenti-EGFP感染組Huh7.5細胞生長增殖狀態(tài)大體-致,各組細胞的生長曲線基本重合。以上結果不僅驗證了第一部分篩選出的CD81siRNA具有良好的干擾效果,也表明CD81的穩(wěn)定干擾并不影響細胞的生長增殖,同時也證明了慢病毒載體介導RNAi穩(wěn)定、高效、安全的特點,顯示出慢病毒載體在RNAi中的優(yōu)越性,為HCV感染的防治提供了新的思路。 三.HCV體外培養(yǎng)體系

13、的建立及CD81穩(wěn)定抑制細胞株抗HCV感染能力的驗證 自1989年發(fā)現HCV以來,國內外一直致力于HCV的體外細胞培養(yǎng),但由于易感物種的局限性,被感染組織和感染者血清中的HCV滴度低以及其自身的高度變異性等原因,在很長一段時間內,HCV體外細胞培養(yǎng)體系都不盡如人意。由于缺乏有效的HCV體外細胞培養(yǎng)體系,嚴重影響了HCV感染入侵分子機制的研究及抗HCV新藥的研發(fā)。2003年,Cosset FL實驗室利用逆轉錄病毒載體的兩個重要特性

14、(可插入外源糖蛋白；復制缺陷的病毒顆粒可整合并表達報告基因),構建了攜帶完整的HCV E1與E2包膜糖蛋白的表達質粒,首次制備出具有感染性的HCV假型包膜病毒顆粒(HCVpp)。該假型病毒模型的包膜蛋白源于完整的HCV包膜糖蛋白,可感染肝源性傳代細胞(如Huh7.5細胞系)或原代肝細胞,并表達其攜帶的特定報告基因(如EGFP、Luc或β-Gal等),大大方便了對HCVpp感染的觀察和檢測。HCVpp呈現出的嗜肝性且可被抗E2的mAb或H

15、CV患者血清中和,故可用作研究HCV感染早期(如宿主嗜性、受體結合、膜融合及血清中和等)的有效模型。2005年,Wakita、Zhong及Lindenbach 3個研究小組先后在特定的細胞系中獲得全序列HCV基因組的表達及感染性HCV顆粒(HCVcc)。具有感染性的完整HCV病毒顆粒在體外的成功培養(yǎng),為HCV的研究揭開了新的篇章。 小結： 1.篩選出1段有效的CD81特異siRNA,構建了CD81shRNA表達質粒pGC

16、si-CD81并通過轉染人肝癌細胞系Huh7.5細胞獲得了CD81穩(wěn)定抑制細胞株。 2.以質粒pGCsi-CD81為基礎,構建了包含CD81shRNA序列及U6啟動子的shRNA慢病毒表達質粒pLenti-shCD81。通過與輔助質粒共轉染,在HEK 293T細胞中包裝出具有高感染性的慢病毒上清,感染Huh7.5細胞,得到了CD81高效穩(wěn)定抑制的細胞株。為研究CD81分子在HCV細胞入侵中的作用提供了良好的基礎,同時也有助于篩選

17、其他HCV入侵相關分子。 3.構建了HCV體外細胞培養(yǎng)模型(HCVcc和HCVpp),以此為平臺,檢驗CD81穩(wěn)定抑制細胞株抗HCV感染能力。通過觀察、檢測和比較,HCVcc及HCVpp對CD81穩(wěn)定抑制Huh7.5細胞株的感染率遠遠低于空白及陰性對照組細胞,證實了CD81分子在HCV細胞入侵中的重要作用,顯示出CD81 RNAi在抗HCV感染中的強大作用,為進一步的體內實驗奠定了基礎,同時也揭示了RNAi在抗HCV治療中的巨大