禽傳染性支氣管炎病毒S1、M、N基因VR1020和pVAX1的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)的四川分離株SAIBK的全基因組序列(序列登錄號(hào)為：DQ288927)設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)從SAIBk基因組中擴(kuò)增出S1、M和N基因，并利用重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)N基因進(jìn)行定點(diǎn)突變處理。將S1、M和N基因，分別插入分泌型真核表達(dá)載體VR1020的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)鑒定成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒VR1020-S1、VR1020-M和VR1020-N。將此三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，用

2、RT-PCR檢測(cè)到目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)，通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到轉(zhuǎn)染VR1020-S1、VR1020-M和VR1020-N的細(xì)胞孔均出現(xiàn)特異的綠色熒光。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在COS7細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 同樣設(shè)計(jì)三對(duì)特異引物，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增SAIBk株的s1、M和N基因，分別導(dǎo)入真核表達(dá)載體pVAX1，成功構(gòu)建S1、M和N基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N。將它們分

3、別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，用RT-PCR和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)同樣檢到S1、M和N基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)及其表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒同樣能在COS7細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 對(duì)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-S1、pVAX1-M、pVAX1-N和VR1020-S1、VR1020-M、VR1020-N，分別以1:1:1(質(zhì)量比)的比例進(jìn)行混合，制備兩種三基因混合DNA疫苗：(VR1020-S1+VR1020-M+VR1020-N)

4、和(pVAX1-S1+pVAX1-M+pVAX1-N)，再分別用脂質(zhì)體包被(脂質(zhì)體和DNA疫苗的質(zhì)量比為10:1)后，進(jìn)行免疫原性實(shí)驗(yàn)。用間接ELISA測(cè)定特異性抗體，結(jié)果表明，(VR1020-S1+VR1020-M+VR1020-N)組和(pVAX1-S1+pVAX1-M+pVAX1-N)組免疫雛雞均能產(chǎn)生特異性抗體，但前者抗體水平顯著高于后者(P＜0.05)；而外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞含量后者高于前者(P＜0.05)；它們

5、對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率分別為72％(13/18)和78％(14/18)。 目前，以分泌型真核表達(dá)載體VR1020來構(gòu)建禽傳染性支氣管炎病毒的DNA疫苗尚未見相關(guān)報(bào)道。用SAIBK毒株的S1、M和N基因與pVAX1載體來構(gòu)建DNA疫苗，也未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了VR1020(胞外表達(dá)載體)和pVAX1(胞內(nèi)表達(dá)載體)用作作家禽DNA疫苗載體的可行性，但前者主要誘發(fā)體液免疫反應(yīng)，后者則主要誘發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究為禽傳染性支氣管炎(IB