禽呼腸孤病毒p17蛋白在細(xì)胞中的定位與其誘導(dǎo)的自噬以及病毒復(fù)制相關(guān).pdf

1、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)，是禽類重要的病原體。病毒基因組是由10個節(jié)段的雙鏈RNA組成，可分為大(L)、中(M)、小(S)3組，主要編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，p17蛋白是由ARV S1基因第二個開放閱讀框編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，包含146個氨基酸，大小約為17kD。由先前的研究可知，p17是細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白，其

2、C端有核輸入信號。而p17在核質(zhì)中的分配與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，且出核并不依賴于CRM1蛋白。p17可以通過PTEN、AMPK和PKR/eIF2α信號通路正調(diào)控細(xì)胞自噬，并增強(qiáng)病毒的復(fù)制。在調(diào)控細(xì)胞周期和宿主細(xì)胞翻譯方面，p17蛋白可以通過激活p53通路來阻礙細(xì)胞的生長。因此，p17蛋白是一種多功能病毒蛋白，它在調(diào)控細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期以及蛋白翻譯方面都起著重要的作用。盡管如此，目前對p17蛋白功能的研究仍然還存在許多未知的地方。本研究通過

3、鑒定p17蛋白的核輸入信號與核輸出信號，并突變p17蛋白核輸入信號相關(guān)的功能氨基酸位點后，探究p17蛋白的細(xì)胞定位對其誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響以及對病毒復(fù)制的影響。
　　1.禽呼腸孤病毒p17蛋白核輸入信號與核輸出信號的鑒定
　　本研究首先將p17蛋白基因插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白GFP-p17，建立了綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞定位的方法。所得結(jié)果也與文獻(xiàn)報道中的p17蛋白定位一致，也于ARV感染后

4、的間接免疫熒光實驗一致，說明本方法可以用于p17蛋白定位的研究。同時，選取轉(zhuǎn)染pEGFP-p17后的不同時間點(9h、18h、24 h、36 h、48 h)，觀察p17蛋白在細(xì)胞中的分布情況。此外，也與p10、σNS另兩個S基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白的定位進(jìn)行了比較，結(jié)果也與p17蛋白在細(xì)胞中的定位不同。
　　為鑒定p17的核輸入信號，參考文獻(xiàn)中報道的序列，并將該序列中以及周圍存在的幾個連續(xù)的堿性氨基酸進(jìn)行突變，觀察p17突變體的細(xì)胞

5、定位情況。發(fā)現(xiàn)突變p17蛋白c端的第122和123位的氨基酸后，可使p17蛋白的核定位發(fā)生改變，觀察到大部分熒光進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，從而確定這兩個氨基酸在p17蛋白的核定位中發(fā)揮著重要的作用。
　　此外，p17是核質(zhì)穿梭蛋白，目前的研究僅知道p17蛋白可以出核，且出核途徑是CRM1蛋白非依賴的。本研究通過軟件預(yù)測與序列比對，在p17蛋白的序列中找到多個疑似核輸出信號的序列。將這些序列插入pEGFP-C1中進(jìn)行表達(dá)鑒定，根據(jù)觀察融合蛋白的

6、表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，在p17蛋白的N端第19-26位有一段氨基酸片段能使細(xì)胞核中大量的GFP進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并認(rèn)為它能夠介導(dǎo)p17蛋白的出核，且這種出核可能是通過CRM1以外的其他途徑。
　　2.禽呼腸孤病毒p17蛋白核輸入信號的突變調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與病毒的復(fù)制
　　已有研究證實，p17可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，但是對于p17調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。本研究探討了p17核輸入信號對其引起細(xì)胞自噬及病毒復(fù)制的影響。為了研究p1

7、7蛋白的核定位與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的關(guān)系，構(gòu)建了突變p17第122位和第123位的氨基酸的重組真核表達(dá)載體。在Vero細(xì)胞和DF1細(xì)胞中，表達(dá)p17核輸入信號突變體短時間內(nèi)的自噬水平均顯著低于表達(dá)野生型p17的細(xì)胞。
　　通過進(jìn)一步檢測p17入核對病毒增殖的影響，轉(zhuǎn)染野生型p17再感染ARV后的病毒復(fù)制水平顯著升高，說明p17可促進(jìn)細(xì)胞自噬的同時促進(jìn)病毒復(fù)制。而在感染病毒一定時間內(nèi)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞p17入核信號突變體并不能明顯的促進(jìn)病毒的復(fù)制