慢性錳中毒誘導大鼠聽覺損傷的研究.pdf

1、第一部分:慢性錳中毒對大鼠聽力及耳蝸細胞形態(tài)的影響
　　目的:通過建立大鼠慢性錳中毒模型,研究錳中毒對大鼠聽力及耳蝸毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞以及線粒體融合蛋白2(mitochdrial fussion protein2,Mfn2)的表達變化的影響。
　　方法:隨機選取60只斷乳21天的SD大鼠,隨機分為染毒組和對照組,染毒組(30只)給予氯化錳水溶液(MnCl2·4H2O100mg/kg/d),連續(xù)灌胃12w,對照組(30只)

2、給予去離子水。分別于染毒4w、8w和12w檢測大鼠血錳濃度,于12w行聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emissions,DPOAE)檢測,基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素(Phalloidin-FITC)染色觀察毛細胞形態(tài)及計數(shù),HE染色觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)及計數(shù),通過透射電鏡(transmission

3、election microscopy,TEM)觀察毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞超微結構的變化,利用Western blot技術檢測Mfn2在耳蝸基底膜和螺旋神經(jīng)元中的表達變化。
　　結果:①大鼠染毒后,其血錳濃度隨時間逐漸增高,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②染毒12w大鼠4、8、16、24、32kHz ABR反應閾明顯增高(P<0.05),其中高頻閾值提高顯著,DPOAE幅值降低。③基底膜鋪片F(xiàn)ITC染色示外毛細胞缺

4、失,其中以底回缺失明顯;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞HE染色示染毒組細胞數(shù)量減少;透射電鏡下,可見染毒組毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞線粒體嵴斷裂或消失,呈空泡樣變;④Western blot結果示,染毒組基底膜和螺旋神經(jīng)元中Mfn2的表達明顯高于正常對照組。結論:慢性錳中毒可以引起大鼠耳蝸毛細胞缺失和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少,進而導致大鼠聽力損傷;耳蝸基底膜和螺旋神經(jīng)元中Mfn2表達增高,其作用機制還有待今后進一步的研究。
　　第二部分:錳誘導體外螺旋

5、神經(jīng)節(jié)細胞(SGNs)凋亡的研究
　　目的:通過建立錳誘導螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷體外模型,觀察錳中毒對螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion cells,SGNs)形態(tài)的影響以及錳誘導SGNs凋亡過程中Bax蛋白的定位。
　　方法:采用原代分離培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細胞,分為染毒組和正常對照組,染毒組的暴露時間分別為6h、12h和24h,給藥濃度為5mM氯化錳水溶液(MnCl2·4H2O),在倒置顯微鏡下觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的形態(tài)

6、;利用β-tublin和Tunel試劑盒分別進行SGNs鑒定和細胞凋亡檢測;采用Mitotraker Green FM熒光探針標記活體SGNs線粒體,通過免疫熒光染色觀察Bax的轉位現(xiàn)象;在透射電鏡下觀察SGNs及其線粒體的超微結構的變化。
　　結果:①倒置顯微鏡下錳暴露6h:細胞胞間隙增大,細胞發(fā)生皺縮,軸突變短;錳暴露12h、24h:細胞胞間隙進一步增大,突觸變短甚至消失,核固縮;②β-tublin和Tunel免疫熒光染色結果