豬囊尾蚴單鏈抗體PE40重組載體構(gòu)建.pdf

1、豬囊尾蚴病是全球性寄生性蠕蟲病，發(fā)展中國家更為常見，尤其在我國，該病的流行給人民生產(chǎn)和生活帶來諸多危害，給人類的健康帶來嚴重的影響。我國至少已有31個省(市、自治區(qū))有過該病的報道，囊尾蚴病患者約1000萬，每年屠宰的囊尾蚴病豬約1200萬頭，直接經(jīng)濟損失約20億元。腦囊尾蚴病對人類的健康危害極大，在某些發(fā)展中國家，腦囊尾蚴病是引起人死亡的主要原因之一。 由于抗藥性的不斷出現(xiàn)以及藥物殘留等問題的嚴重性，使得利用免疫預防技術(shù)來取代

2、藥物成為控制豬囊尾蚴病的必然。免疫毒素是一種導向藥物，它將毒素基因和靶向基因融合，表達融合蛋白，具有識別和選擇性地破壞受體靶細胞的功能，它由導向部分和毒性部分組成。 綠膿桿菌外毒素通常作為重組毒素的毒性成分，其毒性本質(zhì)是它能夠催化真核細胞延伸因子的ADP核糖基化，阻止肽鏈延長并中斷細胞蛋白質(zhì)的合成而行使細胞毒作用。作為重組毒素的導向部分，除能夠與特定靶細胞表面受體結(jié)合外，同時能夠與毒素基因相融合，表達出融合蛋白，且二者不影響各自

3、獨立結(jié)構(gòu)和功能。將豬囊尾蚴頭節(jié)單鏈抗體基因與綠膿桿菌外毒素PE40基因連接，裝入表達載體pET-28(a)中，以獲得重組毒素，研究其對豬囊尾蚴的殺滅作用。 從綠膿桿菌ATCC27853菌株中提取基因組，根據(jù)GenBank發(fā)表的綠膿桿菌外毒素基因全序列，自行設(shè)計引物，分別引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點。 采用PCR方法擴增PE40基因，在反應(yīng)體系中加入10％總體積的甘油，電泳檢測，純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接

4、構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-PE40，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)JM109中，藍白斑篩選陽性克隆菌，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定及PCR鑒定，并測序。 質(zhì)粒pMD18-T-PE40經(jīng)：XbaⅠ和HindⅢ雙酶切后電泳顯示2692bp和1083bp兩條帶，測序結(jié)果顯示擴增的PE40基因共有10個堿基發(fā)生改變，變異的堿基引起7個氨基酸發(fā)生變化，但PE40肽段的重要活性位點與綠膿桿菌標準產(chǎn)毒株P(guān)A103相比均未發(fā)生變化。 含有ScFv基因的質(zhì)粒p

5、MD18-T-ScFv已經(jīng)構(gòu)建，且ScFv基因兩端的酶切位點分別為EcoRⅠ和XbaⅠ，用XbaⅠ和HindⅢ分別對質(zhì)粒pMD18-T-PE40和pMD18-T-ScFv進行雙酶切，利用XbaⅠ和HindⅢ酶切位點將PE40基因與質(zhì)粒pMD18-T-ScFv相連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)JM109中，挑取陽性菌酶切鑒定。 經(jīng)酶切電泳分析，得到大小約為1800bp的目的片段，與預期結(jié)果相同，說明ScFv與PE40已連接成功。用EcoR