油脂代謝途徑中兩種脂肪酶的功能及磷脂酸信號(hào)調(diào)控研究.pdf

1、生物柴油作為柴油能源的可再生替代品，已經(jīng)成為解決能源危機(jī)和環(huán)境污染的研究熱點(diǎn)。在利用酶法催化合成生物柴油的研究中，盡管有一些脂肪酶可以有效催化生物柴油的合成，但仍然不能解決生物柴油生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，主要原因是在生物柴油生產(chǎn)中，脂肪酶的催化效率有限、熱穩(wěn)定性適中，以及原料成本占生物柴油總成本的60％-75％的問(wèn)題，所以脂肪酶和原料油這兩個(gè)關(guān)鍵因素造成了目前生物柴油生產(chǎn)的高成本。因此，研究脂肪酶的催化效率、熱穩(wěn)定性、以及在植物油脂生物合成途

2、徑中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控以及被調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，將有助于揭示脂肪酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及植物油脂生物合成的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也為生物柴油產(chǎn)業(yè)化降低成本奠定重要的理論基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)對(duì)南極假絲酵母脂肪酶B的定點(diǎn)突變及性質(zhì)研究、對(duì)液化沙雷氏菌脂肪酶(SLLipA)的克隆表達(dá)及性質(zhì)研究、以及對(duì)擬南芥三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族6個(gè)成員調(diào)控?cái)M南芥種子油脂含量的研究和信號(hào)分子磷脂酸(PA)對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的相互作用研究，得到了以下結(jié)果： 1)對(duì)CALB的三個(gè)氨

3、基酸位點(diǎn)Asn292Tyr、Va1210Ile和Ala281Glu進(jìn)行定點(diǎn)突變，并根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子體外合成了突變的CALB(muCALB)基因和野生型CALB基因，然后分別整合到畢赤酵母GS115，獲得分泌表達(dá)的重組脂肪酶菌株，篩選表達(dá)脂肪酶活力高的菌株，制備發(fā)酵生產(chǎn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明在誘導(dǎo)表達(dá)48 h時(shí)，在細(xì)胞密度僅達(dá)到OD600=～7的狀態(tài)下，脂肪酶的表達(dá)已經(jīng)達(dá)到最高酶活力11 U mL-1。基于對(duì)CALB的計(jì)算機(jī)輔助的分子模型分析和

4、疏水口袋的特征，設(shè)計(jì)合成了由4-aminobenzamidine和M-aminophenylboronic acid組成的親和介質(zhì)，用于CALB和muCALB的親和純化，這是首次采用具有高度特異性的仿生親和純化配體技術(shù)對(duì)CALB的純化，電泳純度達(dá)到99％。對(duì)純化muCALB的水解性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明對(duì)底物對(duì)硝基苯酚酯的脂肪酸鏈長(zhǎng)具有特異性，隨著對(duì)硝基苯酚酯長(zhǎng)鏈?；脑黾?C10-C18)，其水解活性相應(yīng)從17.3 U mL-1降低至7

5、.1 U mL-1，而野生型CALB水解該底物的特異性不明顯。對(duì)muCALB粗酶的轉(zhuǎn)酯化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明在相同的溫度條件下，反應(yīng)24 h，muCALB催化大豆油轉(zhuǎn)甲酯化的活力是CALB的2.3倍，尤其在55℃，muCALB催化活力最高達(dá)到3.02％，而CALB僅為0.98％，轉(zhuǎn)化率是CALB的3.08倍。對(duì)muCALB熱穩(wěn)定性的研究表明，在85℃處理210 min后，muCALB殘余酶活為20％，而野生型僅有2％的酶活，因此muC

6、ALB的耐高溫穩(wěn)定性增強(qiáng)。 2)采用染色體步移方法，成功從液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)株S33 DB-1中克隆了脂肪酶基因SLLipA，讀碼框含有1845bp，其核酸序列和編碼的氨基酸序列與Serratia marcescens(Acc.No.DQ841349)具有74％的最高同源性；SLLipA具有脂肪酶特異活性位點(diǎn)Glyl-X1-Ser-X2-Gly，因此克隆的SLLipA屬于脂肪酶GxSxG家

7、族成員。將SLLipA ORF在異源宿主畢赤酵母GS115中成功表達(dá)，在含有甘油三酯的Rhodamine-Triglyceride-Agarose平板上篩選到活性高的菌株，用于研究SLLipA重組菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，研究表明在甲醇誘導(dǎo)12 h后檢測(cè)到脂肪酶活性，在48 h時(shí)酶活力最高達(dá)到16 U mL-1。對(duì)SLLipA酶學(xué)功能的分析表明，SLLipA具有底物特異性，最傾向于水解長(zhǎng)碳鏈的ρ-NPS(C18)，其次是中碳鏈的ρ-NPM(C14

8、)和ρ-NPL(C12)。對(duì)催化轉(zhuǎn)甲酯的實(shí)驗(yàn)研究表明，SLLipA沒(méi)有轉(zhuǎn)甲酯活力，是一個(gè)水解類(lèi)脂肪酶。 3)采用種子特異表達(dá)啟動(dòng)子Beta-Conglycinin，將植物中三個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子家族的6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥種子中特異表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子包括Homeobox家族的GL2，MYB家族的WER(R2R3亞家族)、MYB家族中R3亞家族的MYB(At4G01060)、MYB(At2G30420)和GmMYB73，以及B3家族的FU

9、S3。對(duì)GL2、WER、FUS3、MYB(At2G30420)和GmMYB73的轉(zhuǎn)基因T1代種子的油含量分析結(jié)果表明，與野生型相比較，GL2、WER和GmMYB73影響了種子油的含量，而FUS3和MYB(At2G30420)沒(méi)有影響種子油含量，因此推測(cè)GL2、WER和GmMYB73三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與了植物脂質(zhì)的生物合成調(diào)控，該研究為進(jìn)一步揭示轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物油質(zhì)生物合成的機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。 4)為研究轉(zhuǎn)錄因子WER、GL2

10、、FUS3、MYB(At4G01060)和MYS(At2G30420)與脂質(zhì)的相互作用，分別構(gòu)建了這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因融合6XHis的pET28a(+)大腸桿菌表達(dá)載體，在大腸桿菌Roselta(DE3)中成功獲得可溶性表達(dá)蛋白。利用Fatty western blot方法研究脂質(zhì)PA、PC、PE，PG，PI，PS，LPC，LPA，diPA(18:1)，diPA(18:2)，diPA(16:0-18:1)，diPA(16:0-18:2)、

11、DAG(8:0)、DAG(18:0-18:1)、DAG(2:0-18:1)與GL2、WER、FUS3、MYB(At4G01060)、MYB(At2G30420)蛋白的相互作用，研究結(jié)果表明只有磷脂酸(PA)及其特定類(lèi)型PA，包括diPA(18:1)、diPA(18:2)、diPA(16:0-18:1)和 diPA(16:0-18:2)，與GL2和WER存在相互作用，而其它脂質(zhì)與GL2和WER不存在相互作用。另外，轉(zhuǎn)錄因子FUS3、MYB

12、(At4G01060)和 MYB(At2G30420)與所有脂質(zhì)均不存在相互作用。因此，PA與GL2和WER之間存在特異性的相互作用。 5)利用SPR分子相互作用動(dòng)態(tài)分析技術(shù)，以量化PA與WER之間相互作用的強(qiáng)度。對(duì)不同濃度WER與PA相互作用的分析結(jié)果表明，相互作用信號(hào)隨著WER濃度的增加而增強(qiáng)，利用GraphPrism軟件的非線(xiàn)性衰退程序分析了結(jié)合曲線(xiàn)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，計(jì)算出相互作用的平均最適結(jié)合Kd值為1.76E-11(1/s

13、)。 為了定位WER與PA之間相互作用的基序或結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，首先對(duì)WER進(jìn)行了片段缺失，這些缺失片段包括WER(1-65)、WER(66-116)、WER(117-203)、WER(1-116)和WER(66-203)，將各片段構(gòu)建到融合了6XHis的pET28a(+)大腸桿菌表達(dá)載體，在大腸桿菌Roselta(DE3)表達(dá)了可溶性蛋白。利用liposomal binding實(shí)驗(yàn)分析WER(1-65)、WER(117-203

14、)、WER(1-116)和 WER(66-203)片段與PA的相互作用，結(jié)果顯示只有WER(1-65)和WER(1-116)與PA存在結(jié)合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證liposomal binding的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPR技術(shù)對(duì)純化片段缺失蛋白WER(1-65)、WER(1-116)和 WER(66-203)與脂質(zhì)體1PA(18:1)：3PC(18:1)進(jìn)行分析，其結(jié)果與liposomal binding的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，揭示了WER與PA的結(jié)

15、合基序位于片段WER(1-65)。 為了將WER與PA的結(jié)合定位在更小的范圍，將WER(1-51)片段構(gòu)建到融合了6XHis的pET28a(+)大腸桿菌表達(dá)載體，在大腸桿菌Roselta(DE3)中表達(dá)了可溶性蛋白。利用liposomal binding實(shí)驗(yàn)分析WER(1-51)與PA的相互作用，結(jié)果顯示W(wǎng)ER(1-51)與PA不存在相互作用。因此，基序(51KRCGKSCRLRWMNYL65)是PA與WER相互作用所不可缺少的

16、，因而將PA與WER相互作用的范圍縮小到該15個(gè)氨基酸的范圍之內(nèi)。 采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)WER進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)包括單點(diǎn)突變(WERK41A，WERR52A，WERR58A或WERR60A)和雙點(diǎn)突變(WERK51A+R52A或WERR58A+R60A)，將突變基因構(gòu)建到融合了6XHis的pET28a(+)大腸桿菌表達(dá)載體，在大腸桿菌Roselta(DE3)中表達(dá)了可溶性蛋白。利用liposomal binding實(shí)驗(yàn)對(duì)

17、6個(gè)突變蛋白與PA的相互作用進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示與PA都不存在結(jié)合現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證liposomalbinding的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPR技術(shù)對(duì)純化的WERK51A、WERR52A、WERR58A、WERK51A+R52A和WERR58A+R60A蛋白與脂質(zhì)體1PA(18:1):3PC(18:1)進(jìn)行互作分析，結(jié)果與liposomal binding的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，除了對(duì)照WER外，這5個(gè)突變蛋白與脂質(zhì)體均沒(méi)有結(jié)合作用，因此，揭示了P

18、A與WER相互作用所不可缺少的4個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)K51A，R52A，R58A和R60A。該研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示PA與WER相互作用在植物中的調(diào)控功能奠定了重要的基礎(chǔ)。 6)對(duì)擬南芥WER及其突變蛋白WERK51A+R52A和WERRS8A+R60A在煙草葉片中進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究，結(jié)果顯示野生型WER蛋白定位在細(xì)胞核中，但更集中分布在核仁區(qū)，而突變蛋白WERK51A+R52A和WERR58A+R60A只均勻地分布在細(xì)胞核中。該研