禽腫瘤病混感病例中REV基因序列分析及LTR重組MDV的鑒定.pdf

1、雞馬立克氏病(MD)是由雞馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種雞的傳染性、腫瘤性疾病，可導(dǎo)致其主要宿主雞的免疫抑制和以淋巴細(xì)胞增生為特征的腫瘤發(fā)生，直至死亡。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)是另一種致瘤性的疾病，其病原為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)，能引起雞、火雞、鴨和其他禽類的慢性腫瘤、矮小綜合征及免疫器官萎縮等臨床癥狀。近些年來，我國MDV和REV混合感染的病例逐漸增加，二者混合感染導(dǎo)致宿主更早的發(fā)病，臨床癥狀更加嚴(yán)重。此外，污染R

2、EV的MD疫苗也是RE流行的一個(gè)重要來源。這些問題增加了MD和RE的防控難度。皰疹病毒MDV與逆轉(zhuǎn)錄病毒REV在體內(nèi)和體外混合感染，會(huì)發(fā)生REV基因組，尤其是它的LTR序列片段在MDV基因組的整合。LTR具有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的活性，可調(diào)控MDV某些的基因表達(dá)，導(dǎo)致MDV的致病性和水平傳播能力等生物學(xué)特性的改變，對(duì)MDV的演化具有重要意義。本研究從山東省和遼寧省2個(gè)發(fā)生腫瘤病的養(yǎng)雞場采集病料，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和PCR檢測證實(shí)2個(gè)雞群發(fā)生的均為

3、MD。進(jìn)一步的檢測顯示，2個(gè)雞群存在REV的混合感染。為了進(jìn)一步研究混感病料中REV的分子特征，我們?cè)贒F-1細(xì)胞上進(jìn)行了REV的病毒分離，獲得了2株REV病毒株。獲得的毒株利用PCR、間接免疫熒光(IFA)和電鏡觀察等方法進(jìn)行了鑒定。分離到的2株REV分別命名為CY1111株和SY1209株。在此基礎(chǔ)上，對(duì)CY1111株和SY1209株進(jìn)行了前病毒基因組測序，并與其他已發(fā)表的REV分離株進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。根據(jù)基因組不同區(qū)域的

4、序列構(gòu)建了LTR、gag基因、pol基因、env基因和全基因的遺傳進(jìn)化樹。遺傳進(jìn)化樹分析顯示:我們獲得的2株REV分離株和其他中國分離株，除GD1210株外，均位于同一個(gè)進(jìn)化分枝，表明我國REV分離株之間具有較高的遺傳進(jìn)化相關(guān)性。值得注意的是，我們分離的REV CY1111株和SY1209株，與來源于MD商品疫苗中的MD-2毒株之間序列相似性達(dá)到99.8％，遺傳進(jìn)化分析也顯示它們位于同一個(gè)分枝，推測兩個(gè)雞場中的REV可能來源于疫苗污染，

5、這提示我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)MD疫苗的質(zhì)量控制。此外，進(jìn)化分析的結(jié)果現(xiàn)實(shí)REV分離株并沒有表現(xiàn)出宿主或地域的特異性，在自然條件下，REV可能能夠自由地在不同宿主以及不同地域之間傳播。
　　為了研究REV在MDV基因組中整合的發(fā)生，我們采用一種檢測REV LTR在MDV基因組中整合的HS-cPCR(Hot Spot Combined PCR)方法，用于檢測REV LTR在MDV中重組的熱點(diǎn)位置。應(yīng)用該方法對(duì)REV和MDV在體內(nèi)和體外混合感染過

6、程中的病毒之間的插入重組進(jìn)行了檢測。MDV LCY-BAC株為本實(shí)驗(yàn)室在混感REV的MDV野毒株分離過程中獲得的毒株，該毒株經(jīng)細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC)進(jìn)行了病毒純化。對(duì)其檢測發(fā)現(xiàn)，MDV LCY-BAC株基因組中存在兩個(gè)REV的完整LTR序列插入，插入位置分別在基因組的短獨(dú)特區(qū)(Us)兩側(cè)與內(nèi)部短重復(fù)區(qū)(IRs)和末端短重復(fù)區(qū)(TRs)交接處，而且這兩個(gè)LTR的插入方向相同，均為反向插入到MDV基因組。為研究這種重組病毒的遺傳穩(wěn)定性

7、，將LCY-BAC株體外傳至15代，對(duì)第2、5、8、12和15代分別進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTR插入的位置、方向和拷貝數(shù)均沒有發(fā)生變化，證明具有這種REV LTR插入的重組MDV毒株能夠在體外穩(wěn)定遺傳，對(duì)研究MDV和REV之間的重組具有重要意義。通過HS-cPCR檢測來自8個(gè)不同雞群的確診為MDV和REV混合感染的病雞樣品，并沒有發(fā)現(xiàn)有LTR重組的現(xiàn)象，說明自然發(fā)生LTR重組MDV的幾率可能較低。本研究對(duì)混合感染病料中的REV進(jìn)行了病毒分