日本血吸蟲組成型高表達(dá)HSPs生物信息學(xué)分析及Sjp40的RNA干擾效應(yīng)探索.pdf

1、血吸蟲病流行廣泛，危害嚴(yán)重。但由于其生活史的復(fù)雜性以及血吸蟲在宿主體內(nèi)發(fā)展了較強(qiáng)的免疫逃避機(jī)制等，目前尚沒有可用于臨床或現(xiàn)場的具有穩(wěn)定的良好保護(hù)力的疫苗。血吸蟲與宿主相互關(guān)系的分子機(jī)制亦待進(jìn)一步研究。調(diào)控、自穩(wěn)、自適應(yīng)是生命體的本來屬性，血吸蟲依賴自身應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制在面對各種脅迫因子及宿主機(jī)體防御攻擊而維持自身穩(wěn)定發(fā)育成熟，在這一過程中熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)應(yīng)發(fā)揮著重要的作用。HSPs在許多生物體細(xì)

2、胞進(jìn)程和應(yīng)激處理過程中作用關(guān)鍵，熱休克反應(yīng)是一種普遍的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，保護(hù)細(xì)胞和整個(gè)生物體面對環(huán)境壓力的有害影響。有研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲在紫外致弱處理?xiàng)l件下，HSP70呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢，而HSP90、HSP60呈現(xiàn)下調(diào)。血吸蟲HSPs超家族內(nèi)的協(xié)同效應(yīng)及其機(jī)制，值得深入探討。
　　Sjp40是日本血吸蟲主要蟲卵抗原，呈現(xiàn)組成型表達(dá)，具有潛在的早期診斷價(jià)值。研究闡明曼氏血吸蟲主要蟲卵抗原P40(SmP40)隸屬于具有α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域的小熱休

3、克蛋白sHSP20家族。sHSP(12000-43000)是HSPs超家族的重要成員，與細(xì)胞抗凋亡及生物體應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。這些HSPs基因在日本血吸蟲抗脅迫維自穩(wěn)中應(yīng)扮演了重要的角色。本研究對HSPs進(jìn)行生物信息學(xué)分析并通過浸泡法轉(zhuǎn)染dsRNA進(jìn)行RNA干擾以沉默日本血吸蟲sHSP-Sjp40基因，探究其干涉效應(yīng)及其對其他組成型高表達(dá)SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的協(xié)同效應(yīng)。
　　一、日本血吸蟲組成型高表達(dá)H

4、SPs生物信息學(xué)分析及克隆表達(dá)鑒定
　　目的：生物信息學(xué)分析日本血吸蟲HSPs超家族中組成型高表達(dá)Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因，并進(jìn)行克隆、表達(dá)、鑒定。
　　方法：
　　1.通過相關(guān)文獻(xiàn)檢索日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫SjTPdb等找尋日本血吸蟲組成型高表達(dá)HSPs基因。
　　2.通過BLAST服務(wù)平臺(tái)及MEGA4.0軟件對Sjp40基因結(jié)構(gòu)域及同源性進(jìn)行分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

5、
　　3.通過ExPASy服務(wù)器中的ProtParam工具、SMART程序、Tmpred程序、PSORT程序等對SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90、Sjp40基因編碼蛋白序列進(jìn)行分析。
　　4.以DNAMAN選取HSPs基因全長編碼區(qū)域設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增，得到純化后的產(chǎn)物克隆到pET-32a(+)載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。
　　5.以抗Sjp4

6、0單抗6F10通過Western blot檢測pET-32a(+)-Sjp40重組蛋白免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)果：
　　1.sHSP-SJCHGC06324/AY814158.1、HSP60-SJCHGC09129/AY813151.1、HSP70-SJCHGC06292/EZ000074、HSP90-SJCHGC00820/AY815927.1在日本血吸蟲生活史各期轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組中呈現(xiàn)高豐度組成型高表達(dá)情況。
　　2.

7、Sjp40隸屬于具有α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域的小熱休克蛋白sHSP20家族，同時(shí)檢索已報(bào)道的曼氏血吸蟲和日本血吸蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)P40家族合計(jì)有39條高度同源均具有α晶體蛋白結(jié)構(gòu)域的基因，其中具有完整讀碼框的cDNA有19條，并且Sjp40與SJCHGC06324蛋白序列高度同源。
　　3.SjHSP60蛋白序列和SjHSP70蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主;SjHSP90蛋白序列和Sjp40蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以

8、無規(guī)則卷曲為主，而SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因編碼蛋白均是跨膜蛋白，四種HSPs含有多個(gè)修飾位點(diǎn)及潛在的抗原表位。
　　4.原核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸埃希菌中表達(dá)了重組蛋白。
　　5.重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-Sjp40以融合蛋白形式可溶性表達(dá)重組蛋白，Western blot顯示重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)論：

9、　　日本血吸蟲生活史各期轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組中有四種HSPs基因呈現(xiàn)高豐度、組成型、高表達(dá)狀況。日本血吸蟲主要蟲卵抗原Sjp40隸屬于小熱休克蛋白家族，并且Sjp40與SJCHGC06324高度同源。SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因編碼蛋白均是跨膜蛋白，并且含有多個(gè)修飾位點(diǎn)及潛在的抗原表位。Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因克隆到pET-32a(+)載體中獲得誘導(dǎo)表達(dá)，抗Sjp40單抗6F10可

10、識(shí)別重組表達(dá)的Sjp40。
　　二、日本血吸蟲小熱休克蛋白Sjp40的RNA干擾效應(yīng)探索
　　目的：研究日本血吸蟲小熱休克蛋白(sHSP)Sjp40基因的RNA干擾（RNAi）效應(yīng)及其干擾后日本血吸蟲HSP60、HSP70、HSP90基因在mRNA水平出現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)，觀察各期蟲體Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA表達(dá)水平。
　　方法：
　　1.設(shè)計(jì)兩端含T7啟動(dòng)子PCR引物從尾

11、蚴cDNA文庫中擴(kuò)增Sjp40基因和陰性對照GFP基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后通過RNAi試劑盒體外轉(zhuǎn)錄直接純化合成dsRNA。
　　2.日本血吸蟲尾蚴（湖南株）自陽性釘螺逸出，經(jīng)腹部感染新西蘭兔和BALB/c小鼠。并用蓋玻片粘取液面尾蚴，機(jī)械斷尾獲取童蟲。新西蘭兔及小鼠于感染后42～45d剖殺，經(jīng)門靜脈灌注收集成蟲，并收集蟲卵。尾蚴、成蟲及蟲卵經(jīng)PBS洗滌后備用。
　　3.將獲取的成蟲用PBS(pH7.4)沖洗3次以上后轉(zhuǎn)入

12、RPMI1640培養(yǎng)基中（含10mM Hepes，10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素），置5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。
　　4.通過浸泡法轉(zhuǎn)染20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml dsSjp40及dsGFP，同時(shí)設(shè)立空白對照組。5％CO237℃培養(yǎng)7天后收集處理組及對照組成蟲，PBS洗滌3次后備用。
　　5.按TRIzol試劑說明書提取日本血吸蟲尾蚴、成蟲、蟲卵及干擾后成蟲總RNA，DNa

13、seⅠ消化，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Sjp40基因及SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA的表達(dá)。
　　6.按TRIzol試劑使用說明提取成蟲可溶性總蛋白(total soluble protein，TSP)。Western blot檢測dsRNA處理后蛋白表達(dá)情況。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用析因設(shè)計(jì)資料的方差

14、分析方法進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯著性水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.Sjp40基因在第3d、5d、7d培養(yǎng)過程中其mRNA表達(dá)水平變化無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.以空白對照組為基線，與其相比不同RNAi劑量轉(zhuǎn)染后Sjp40 dsRNA轉(zhuǎn)染組中Sjp40基因的轉(zhuǎn)錄水平變化有顯著性差異(F=24.301，P=0.001)，下降了80％以上，而GFPdsRNA轉(zhuǎn)染組中Sjp40

15、基因轉(zhuǎn)錄水平變化無顯著性差異(P＞0.05);蛋白質(zhì)水平較空白對照及陰性對照組(dsGFP)出現(xiàn)明顯降低，qPCR結(jié)果顯示在dsSjp40 RNAi后SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的mRNA表達(dá)水平變化無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.轉(zhuǎn)染后Sjp40 dsRNA轉(zhuǎn)染組在相對分子量55000-70000處出現(xiàn)高表達(dá)的蛋白條帶，是否是由于協(xié)同效應(yīng)引起，有待進(jìn)一步研究。
　　4.Sjp40、SjHSP6