銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的機(jī)制與功能研究.pdf

1、[研究背景]
　　 銀屑病是一種常見(jiàn)的多基因遺傳、多環(huán)境因素誘導(dǎo)的慢性炎癥性增殖性皮膚病。目前認(rèn)為銀屑病不僅僅只是一種皮膚疾病，因?yàn)殂y屑病患者往往伴有糖尿病、高血壓、冠心病、肥胖、抑郁和代謝綜合征等系統(tǒng)性疾病，所以，銀屑病現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響廣大人民群眾身心健康的復(fù)雜性疾病之一。
　　 眾所周知，外用糖皮質(zhì)激素制劑在治療銀屑病中應(yīng)用最廣泛，是銀屑病治療的一線藥物，其對(duì)銀屑病皮損的清除十分迅速有效。糖皮質(zhì)激素(Glucocor

2、ticoid，GC)的作用如此強(qiáng)大，主要是通過(guò)其受體--糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor，GR)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。GR屬于核受體家族，廣泛分布于幾乎所有細(xì)胞上。
　　 大量研究表明GR能夠在細(xì)胞核和細(xì)胞漿之間穿梭。在沒(méi)有激素的情況下，GR主要存在于細(xì)胞胞漿中，與分子伴侶和其他蛋白組成多蛋白復(fù)合物。GC與GR結(jié)合后誘導(dǎo)多蛋白復(fù)合物發(fā)生構(gòu)象變化，促使GR從復(fù)合物中解離，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中。根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的不同，未轉(zhuǎn)化

3、的GR可以位于胞漿或胞核中。一旦與配體結(jié)合，未轉(zhuǎn)化的GR即通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，細(xì)胞核中GR與特異性DNA序列糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 我們的初步研究表明，正常人角質(zhì)形成細(xì)胞中GR位于細(xì)胞核中，而銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中GR則位于細(xì)胞漿中，即銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中GR發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。哪些因素導(dǎo)致了GR核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的發(fā)生?GR核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的機(jī)制和意義是什么?這些問(wèn)題促使我們通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)和建立銀屑病小

4、鼠模型對(duì)銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞中GR的表達(dá)和功能進(jìn)行深入的綜合分析，探討GR在銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化及其在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用。
　　 [目的]
　　 明確在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中，存在糖皮質(zhì)激素受體的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；闡明銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的原因以及可能的信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用；明確導(dǎo)致銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的與糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的分子及其作用

5、；闡明銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的意義，從而通過(guò)促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)位，發(fā)現(xiàn)治療銀屑病的新方法。
　　 [方法]
　　 第一部分：間接免疫熒光法檢測(cè)糖皮質(zhì)激素受體在正常表皮和銀屑病皮損的表達(dá)和定位；分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，以間接免疫熒光法檢測(cè)糖皮質(zhì)激素受體在細(xì)胞中的定位；以WesternBlot法比較糖皮質(zhì)激素受體在正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)；ELISA法檢測(cè)銀屑病患者外周血中

6、促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的水平；將細(xì)胞因子(如VEGF16s和IFN-γ等)與體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞共孵育，間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)糖皮質(zhì)激素受體的核質(zhì)分布影響。
　　 第二部分：分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，與GSK-3、p53和微管蛋白抑制劑共培養(yǎng)，間接免疫熒光法檢測(cè)上述因素對(duì)糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)位的影響；以外源性細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)的正常人和銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞，間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)糖皮質(zhì)激素受體的影響。
　　

7、 第三部分：外用咪喹莫特誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生銀屑病樣皮損；靜脈注射IL-13和微管抑制劑vincristine，觀察對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮損的影響；對(duì)小鼠標(biāo)本進(jìn)行Masson三染，評(píng)價(jià)IL-13和vincristine對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 一、糖皮質(zhì)激素受體在銀屑病表皮和正常表皮的定位和定量表達(dá)：
　　 1.糖皮質(zhì)激素受體強(qiáng)烈表達(dá)于銀屑病表皮和正常表皮除角質(zhì)層外的各層細(xì)胞；

8、>　　 2.糖皮質(zhì)激素受體在銀屑病表皮和正常表皮細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的：糖皮質(zhì)激素受體位于銀屑病表皮細(xì)胞的胞漿中，而在正常表皮細(xì)胞中卻位于胞核內(nèi)；
　　 3.體外培養(yǎng)的銀屑病和正常角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的分布與組織免疫熒光結(jié)果一致：糖皮質(zhì)激素受體位于銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的胞漿中，而位于正常角質(zhì)形成細(xì)胞的胞核內(nèi)；
　　 4.銀屑病與正常角質(zhì)形成細(xì)胞之間糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)量無(wú)差異；
　　 二、銀屑病與正常角質(zhì)形

9、成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運(yùn)影響因素：
　　 1.銀屑病患者與正常對(duì)照之間外周血促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇水平無(wú)差異；
　　 2.VEGF165和IFN-γ可誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；
　　 3.地塞米松可逆轉(zhuǎn)VEGF165和IFN-γ誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；
　　 4.內(nèi)皮素-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、白介素10、白介素13、白介素17、血小板源性生長(zhǎng)因子AA/AB/BB

10、對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)影響；
　　 5.ATP水平對(duì)正常角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)影響。
　　 三、銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙機(jī)制：
　　 1.p53抑制劑可抑制VEGF165和IFN-γ誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；
　　 2.微管抑制劑vincristine可抑制糖皮質(zhì)激素受體的核攝取；
　　 3.GSK-3抑制劑不能抑制糖皮質(zhì)激素受體的核

11、攝取；
　　 4.地塞米松促進(jìn)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞胞漿糖皮質(zhì)激素受體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；
　　 5.IL-13，PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB可促進(jìn)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，而ET-1、HGF，TGF-β1、IL-10和IL-17不能促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；
　　 6.突然撤去地塞米松可誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體聚集在胞漿中。
　　 四、IL-13和微管

12、抑制劑對(duì)瞇喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型的影響：
　　 1.咪喹莫特誘導(dǎo)的Balb/c小鼠模型具有銀屑病的主要特征，包括表皮過(guò)度增殖肥厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和真皮微血管增生；
　　 2.IL-13可減輕咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠的紅斑、鱗屑、表皮厚度和浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞的數(shù)目；
　　 3.微管抑制劑可加重咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠的紅斑、鱗屑和微血管數(shù)目。
　　 [結(jié)論]
　　 一、銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生了核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙

13、；
　　 二、銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙與體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇水平無(wú)關(guān)；
　　 三、VEGF165和IFN-γ可誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，而地塞米松可逆轉(zhuǎn)此誘導(dǎo)效應(yīng)；
　　 四、角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是非APT依賴的；
　　 五、VEGF165和IFN-γ誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙需要p53參與；
　　 六、微管介

14、導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體的核攝取，p53介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體的核輸出，而GSK-3抑制劑不能抑制糖皮質(zhì)激素受體的核轉(zhuǎn)運(yùn)；
　　 七、地塞米松促進(jìn)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)運(yùn)需要微管參與；
　　 八、IL-13、PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB可促進(jìn)銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；
　　 九、突然撤去地塞米松可誘導(dǎo)正常角質(zhì)形成細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體聚集于胞漿；
　　 十、IL-1