有機陽離子轉運體介導的普拉克索吸收與排泄機制研究.pdf

1、近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展和應用，存在于人體組織細胞中的轉運蛋白的分子結構和功能逐漸為人們所認識，它們在營養(yǎng)物質及藥物的吸收或外排過程中起著十分重要的作用，并且具有高度的選擇性和特異性。有機陽離子轉運體（Organic cation transporters，OCTs）表達于腎臟、肝臟和小腸，可以介導許多內源性胺類和藥物的吸收與消除。OCT的底物分布廣泛，臨床應用的藥物大約有50％是有機陽離子藥物，包括抗心律失常藥、抗帕金森藥、抗

2、組胺藥、β-腎上腺素受體拮抗藥等。普拉克索（pramipexole，PPX）在生理條件下是以有機陽離子的形式存在的，但OCT介導的PPX體內過程研究尚不清楚。因此，本課題擬研究 OCT在 PPX黏膜吸收和腎臟排泄中的作用，并探討OCT介導的PPX與西咪替丁發(fā)生藥物相互作用的風險。
　　本文首先建立了PPX在不同生物基質中的LC-MS/MS定量分析方法。選用d3-PPX作為內標，分別采用蛋白沉淀結合弱陽離子交換固相萃取（Solid

3、phase extraction，S P E）和乙酸乙酯液液萃取的方法處理組織樣品和其它生物基質，并通過柱后推注法、預處理后加樣法、源內多反應監(jiān)測（In-source multiple reaction monitoring，IS-MRM）直接評價甘油磷酸膽堿（Glycerophosphocholines，GPChos）和溶血甘油磷酸膽堿（Lyso-glycerophosphocholines，Lyso-GPChos）的方法系統(tǒng)評價了基

4、質效應的產生和消除機制，成功解決了組織樣品中內源性成分對分析測定的干擾。采用Ultimate? XB-CN柱進行色譜分離，分析時長僅為3.0 min，保證了高通量的樣品分析。方法學驗證結果表明P P X的血漿和組織樣品在0.05-100 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數r>0.99，低、中、高三個QC濃度測定的日內、日間精密度（RSD）均小于10.6%，血漿和腦組織的準確度分別為95.2%~105.6%和91.4%~108.2

5、%，提取回收率在80.7%~90.3%的范圍內，基質效應偏差為-13.8%~-1.2%，不同條件下穩(wěn)定性的偏差在±15%的范圍內，各項指標均符合生物樣品分析方法驗證的相關要求。表明該方法準確、靈敏，可以滿足體內、體外相關試驗的需求。
　　為考察 OCT在 PPX腸道吸收中可能發(fā)揮的作用，本課題利用擴散池模型研究了PPX在大鼠十二指腸、空腸及回腸的雙向轉運情況，并通過不同種類的抑制劑試驗初步推測PPX可能的轉運機制。結果顯示在1-5

6、0μM的濃度范圍內，PPX從AP-BL側（黏膜側-漿膜側）和BL-AP側（漿膜側-黏膜側）跨大鼠不同腸段的累計通透量均呈線性，且分泌方向要高于吸收方向。在回腸中，加入有機陽離子轉運體抑制劑（金剛烷胺、胍、普魯卡因胺、四乙胺、奎寧和維拉帕米）后，PPX的累計通透量明顯降低。但是，在十二指腸和空腸的試驗中，只有部分抑制劑有抑制效果，表明OCT可能介導了PPX在大鼠腸道的外排轉運，且其在小腸的表達存在區(qū)域性差異。此外，其他轉運體（如P-gp）

7、也可能參與PPX的轉運過程。總之，上述結果提示有機陽離子轉運體對PPX腸道吸收的貢獻較小，提示OCT介導的PPX口服吸收過程中產生臨床DDI的風險較低。
　　由于帕金森疾病（Parkinson’s disease，PD）的病變部位位于顱內，PPX口服給藥后藥物需要透過腸黏膜吸收進入體循環(huán)后進而跨過血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）才能實現腦內遞藥，這將會使藥物向腦內的遞送速率和遞送量大大下降，極大地限制了P

8、PX對PD的治療?；谏鲜隹紤]，我們嘗試通過改變給藥方式來增加PPX向腦內的遞送。鼻腔和腦在生理學上存在獨特的聯系，且鼻腔給藥后藥物可以直接通過“鼻-腦”通路繞過BBB進入腦內，從而增加藥物的腦內遞藥。因此，接下來考察了PPX鼻黏膜給藥后實現腦內“靶向”遞藥的可能性。通過小鼠腦組織勻漿法和切片法研究 PPX靜脈給藥、口服給藥和鼻腔給藥后在血漿和腦組織中的藥動學過程，并采用ADAPT5軟件對主要的藥動學參數進行了擬合。模型擬合結果顯示靜脈

9、給藥和口服給藥后PPX在體內呈一級動力學過程，鼻腔給藥后藥物的轉運為飽和吸收過程，但被動擴散也可能是轉運機制之一，且約有20%的藥物是通過“鼻-腦”通路直接轉運入腦的。與口服給藥相比，鼻腔給藥后腦內PPX的達峰時間從1 h提前至30 min，Cmax由14.65±0.43 ng/g增加至20.37±6.30 ng/g，腦靶向效率為口服給藥組的1.3倍，證明鼻腔給藥可以更快地實現腦內遞藥，提高腦內藥物濃度。小鼠冠狀腦切片模型結果顯示鼻腔給

10、藥后2 min-20 min每個取樣時間點，腦內藥物濃度的變化趨勢呈先下降后上升的趨勢（從“頭”到“尾”），符合鼻腔給藥的特點。上述結果提示對PPX而言，鼻腔給藥比口服給藥更有優(yōu)勢，而且鼻腦直接轉運通路對PPX轉運入腦發(fā)揮了重要作用。
　　在PPX鼻腔給藥的藥動學研究基礎上，進一步研究了PPX跨鼻黏膜轉運的機制。采用牛鼻黏膜離體組織模型和相關的分子生物學技術考察了 OCT在 PPX跨牛鼻黏膜轉運中的作用。結果顯示PPX在牛嗅黏膜M

11、-S方向（黏膜側-黏膜下側）的轉運呈飽和趨勢，且高于S-M（黏膜下側-黏膜側）方向，米氏方程擬合后，最大轉運速率Jmax為18.62±5.46 ng cm-2 min-1，Km值為44.66±22.65μM。而在呼吸黏膜中兩個方向的轉運速率基本一致。加入不同種類的有機陽離子轉運體抑制劑后，PPX在嗅黏膜中的轉運和攝取過程均被抑制，而在呼吸黏膜中，只有攝取被抑制，轉運速率無顯著變化。提示OCTs尤其是OCT1和OCT2可能主要介導了PPX

12、跨嗅黏膜的轉運過程，但在其跨呼吸黏膜的吸收過程中貢獻較小。孵育介質不同離子組成對PPX跨牛嗅黏膜轉運的影響結果顯示該轉運過程依賴于跨膜電勢，但不依賴于pH梯度和鈉離子，進一步從轉運體轉運機制層面證明了OCT介導了PPX跨鼻黏膜的轉運。此外，通過Western Blot技術和免疫組化技術考察了OCT1和OCT2在牛鼻黏膜中的表達情況，結果顯示OCT1和OCT2不僅表達在牛鼻黏膜的頂膜側（黏膜側），還分布在黏膜下的廣大區(qū)域，如血管、腺體、淋

13、巴管等，提示這可能與腎臟中OCT1和OCT2的作用相似，主要協助PPX進入或離開這些區(qū)域。
　　對于PPX這個有機陽離子化合物而言，OCT在其腸道吸收過程中存在一定的作用，而在牛鼻黏膜的轉運中也發(fā)揮著重要作用，這提示我們可以充分利用OCT這個作用靶點進行藥物設計或遞送。此外，OCT在腎臟也高度表達，PPX吸收后在體內的處置過程是否也跟OCT有關是一個非常值得我們關注的問題。因此，研究了腎臟OCT介導的PPX排泄機制，選擇臨床常用藥

14、物西咪替丁（OCT的底物和競爭性抑制劑）為合并用藥藥物，采用整體動物模型、離體腎切片模型及轉染細胞模型考察西咪替丁對PPX腎臟排泄的影響，并探討兩者發(fā)生藥物相互作用的風險和機制。整體動物的藥動學研究表明當西咪替丁與PPX同時給藥后，與對照組相比PPX的血漿AUC(0-12h)增加了2.45倍，平均血漿清除率下降了2.30倍，而PPX在24 h內的累積尿藥排泄量顯著下降，腎臟清除率下降了3倍。表明西咪替丁抑制了PPX的腎臟排泄和在血漿中的

15、清除，提示在腎臟排泄過程中，PPX和西咪替丁是由相同的轉運體系統(tǒng)介導的，臨床合用西咪替丁可能降低PPX的腎排泄作用。腎切片試驗表明OCT抑制劑胍（1 mM）、西咪替?。?.5 mM和1 mM）以及0.1 mM-1 mM濃度范圍的TEA均對PPX的腎臟攝取有顯著抑制作用，且具有濃度依賴性，提示這種相同的轉運體系統(tǒng)與OCT相關。轉染細胞試驗進一步從分子水平證明了西咪替丁是通過抑制OCT2而影響PPX腎臟排泄的，且西咪替丁的Cu,max/IC