重組腺病毒介導(dǎo)DN-JNK1干預(yù)SD大鼠非酒精性脂肪肝病細(xì)胞凋亡及作用機(jī)理.pdf

1、目的：應(yīng)用表達(dá)失活型c-jun氨基激酶1的重組腺病毒(recombinant adenovirus expressing dominant negative type c-Jun N-terminal kinasel,Ad-DN-JNK1)，對(duì)非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其改善肝細(xì)胞凋亡的效果，并對(duì)JNK1引起NAFLD肝細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制進(jìn)行初步探討

2、。
　　 方法：完全隨機(jī)法將48只SD大鼠分為2組，正常飲食組(normal diet group,NG)16只和高脂飲食組(high-fat diet group,HG)32只，對(duì)照組喂普通飼料，高脂組喂高脂飼料。第8w末隨機(jī)從NG和HG各抽取8只大鼠，門靜脈抽血和留取肝組織行病理檢查鑒定成模。余下的8只NG大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料至12w末稱為12w對(duì)照組(NG12w)，余下的24只HG大鼠隨機(jī)分為12w高脂(HG12w)、攜帶

3、綠色熒光蛋白的腺病毒(recombinant adenovirus expressing green fluorescence protein,Ad-GFP)組、Ad-DN-JNK1組，每組各8只，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，上述四組喂養(yǎng)至12w末。第8w末，NG12w組及HG12w大鼠均尾靜脈注入1ml生理鹽水作為安慰劑組對(duì)照，Ad-GFP組大鼠尾靜脈注入1ml2.0×1010pfu的Ad-GFP作為腺病毒對(duì)照，Ad-DN-JNK1組大鼠尾靜脈

4、注入1ml2.0×1010pfu的Ad-DN-JNK1作為治療組。處死前隔夜禁食并稱重；每只大鼠經(jīng)門靜脈取血，離心分離血清，用于測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FBS)、血清胰島素(FIns)、游離脂肪酸(FFAs)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；計(jì)算空腹胰島素抵抗指數(shù)(FIRI)；游離肝臟并稱重，計(jì)算肝指數(shù)；取小塊肝組織剪碎，倒入玻璃勻漿器中勻漿，制成10％的肝組織勻

5、漿，用于測(cè)定肝勻漿FFAs、SOD、MDA含量；取大鼠肝右葉組織行病理切片，HE染色，評(píng)價(jià)肝臟脂肪變性程度。并制作石蠟切片，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)JNK1在肝組織中的表達(dá)。TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：（1）HG大鼠體重、肝指數(shù)、血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FIRI、FFAs、TNF-α水平及肝勻漿FFAs、MDA，JNK1蛋白表達(dá)，凋亡細(xì)胞數(shù)量與同期正常對(duì)照組比較明顯升高，肝勻漿SOD降低，差異均具有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.05）；而FBS沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；Ad-GFP和HG12w大鼠比較，上述各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＞0.05）。（2）與HG12w及Ad-GFP組大鼠比較，Ad-DN-JNK1組的體重、肝指數(shù)、血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FIRI、FFAs、TNF-α水平及肝勻漿FFAs、MDA下降，SOD升高，JNK1蛋白表達(dá)降低，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

7、p均＜0.05）。Ad-DN-JNK1組與NG12w大鼠比較，體重、肝指數(shù)、血清AST、FIns、FIRI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＞0.05）。其余血清學(xué)及肝勻漿指標(biāo)、JNK1蛋白表達(dá)水平、凋亡細(xì)胞數(shù)量未恢復(fù)到正常水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p均＜0.05）。（3）光鏡下，HG8w大鼠肝臟出現(xiàn)空泡樣脂肪變性，HG12w大鼠肝臟空泡樣脂肪變性呈彌漫性，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Ad-GFP和HG12w大鼠均進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alc

8、oholic steatohepatitis，NASH)；而Ad-DN-JNK1組大鼠肝臟脂肪變性明顯改善，未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。（4）JNK1的蛋白表達(dá)強(qiáng)度與肝細(xì)胞凋亡水平呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.822，P＜0.01）。
　　 結(jié)論：1.SD大鼠高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)8周可形成單純性脂肪肝，12周可形成NASH；
　　 2.高脂飲食可誘導(dǎo)肝組織JNK1蛋白表達(dá)增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，呈現(xiàn)時(shí)間依