ALI時肺內(nèi)TREMs家族表達(dá)譜的變化、TREM-2的保護(hù)作用及血管活性腸肽的調(diào)控.pdf

1、本課題觀察到TREM-2在AM和成纖維細(xì)胞表達(dá)較為豐富。因此，深入研究TREM-2對AM炎癥啟動與放大和對成纖維細(xì)胞凋亡的影響，可明確TREM-2在ALI早期的作用及地位，有利于闡明ALI的發(fā)病機(jī)制，篩選新的治療靶點(diǎn)。
　　 血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽之一，具有增強(qiáng)支氣管上皮細(xì)胞的趨化遷移、擴(kuò)張血管、舒張氣道平滑肌、清除氧自由基及抗細(xì)胞凋亡等多種生

2、物學(xué)作用。肺內(nèi)VIP是否可通過調(diào)控TREM-2的表達(dá)，使ALI時肺內(nèi)炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)處于對機(jī)體有利而又不會造成組織器官損傷的范圍內(nèi)值得探討。
　　 目的:分析ALI時肺內(nèi)TREMs家族表達(dá)譜的變化，探討TREM-2在肺內(nèi)的功能以及VIP對TREM-2的表達(dá)調(diào)控。
　　 方法:(1)腹腔注射LPS復(fù)制小鼠ALI動物模型，采用Buxco小動物呼吸功能檢測系統(tǒng)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)驗(yàn)證模型的建立;RT-PCR和Western Blot

3、法檢測肺組織中TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表達(dá);RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測AM、成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4的表達(dá)。(2)構(gòu)建pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染AM，采用熒光顯微鏡、RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測TREM-2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和表達(dá);RT-PCR和ELISA檢測TREM-2對

4、LPS應(yīng)激的AM中TNF-a和IL-10表達(dá)的影響;RT-PCR檢測TREM-2對LPS應(yīng)激的AM中NF-κB mRNA表達(dá)的影響，免疫熒光檢測TREM-2對LPS應(yīng)激的AM中NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響。(3) pEGFP-N1質(zhì)粒和pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞，采用熒光顯微鏡和Real-time PCR檢測pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)和PI染色檢測TREM-2對成纖維細(xì)胞凋亡的影

5、響;RT-PCR和凋亡蛋白活性檢測試劑盒檢測成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8及caspase9的表達(dá)和活性。(4)構(gòu)建pGC-FU-VIP重組慢病毒并感染昆明小鼠;RT-PCR和Western Blot檢測VIP對ALI小鼠肺組織中TREM-2表達(dá)的影響，并采用Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測VIP對LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2表達(dá)的調(diào)控及其機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.ALI時小鼠肺內(nèi)TRE

6、Ms家族的表達(dá)譜分析
　　 (1) Buxco小動物肺功能檢測顯示:ALI小鼠的呼吸頻率、肺順應(yīng)性、潮氣量均低于正常小鼠;而ALI小鼠氣道阻力明顯大于正常小鼠的氣道阻力(P＜0.05)。進(jìn)一步采用HE染色觀察到ALI小鼠的肺泡隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤，滲出明顯增加。
　　 (2) TREMs家族的主要成員TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4在正常小鼠肺組織中均有表達(dá)，其中以TREM

7、-1的表達(dá)最少，TREM-2的表達(dá)最多。與正常組相比，ALI組小鼠肺組織中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2和TLT-4 mRNA的表達(dá)均明顯升高，而TREM-2 mRNA的表達(dá)降低(P＜0.05)。Westem Blot檢測TREM-1和TREM-2表達(dá)的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。
　　 (3) RT-PCR檢測結(jié)果顯示:靜息狀態(tài)的成纖維細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞均表達(dá)TREM-2 mRNA，但未

8、見明顯的TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4 mRNA的表達(dá);靜息狀態(tài)的AM表達(dá)TREM-1、TREM-2、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4mRNA，而LPS應(yīng)激的AM中TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及TLT-4 mRNA表達(dá)均升高，但TREM-2 mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與上述RT-PCR結(jié)果一致。
　　 2.pEGFP-N1/TREM-

9、2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及TREM-2對AM炎癥啟動和放大效應(yīng)的影響
　　 (1)成功構(gòu)建pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至AM。熒光顯微鏡檢測顯示轉(zhuǎn)染效率約為40％。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測顯示pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中TREM-2表達(dá)明顯高于pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。
　　 (2) RT-PCR檢測顯示LPS應(yīng)激的AM中TNF-a mRNA表達(dá)明顯增加。與LPS

10、+pEGFP-N1質(zhì)粒組相比，LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的AM中TNF-a mRNA表達(dá)明顯降低。ELISA檢測結(jié)果顯示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM的上清液中TNF-a蛋白含量（260.64±47.58）pg/mL明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（352.16±43.82）pg/mL(P＜0.05)。
　　 (3) RT-PCR檢測表明:與LPS+pEGFP-N1質(zhì)

11、粒轉(zhuǎn)染組相比，LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中IL-10mRNA表達(dá)明顯升高。ELISA檢測結(jié)果顯示LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM的上清液中IL-10蛋白含量（242.96±63.23）pg/mL明顯高于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（184.38±34.33）pg/mL(P＜0.05)。
　　 (4)LPS組的AM中NF-κB mRNA的表達(dá)明顯高于正常對照組;LPS+p

12、EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的AM中NF-κB mRNA的表達(dá)明顯高于pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中NF-κB mRNA的表達(dá)明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。與正常對照組相比，LPS應(yīng)激的AM中NF-κB的核轉(zhuǎn)位明顯增多;LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組AM中NF-κB核轉(zhuǎn)位明顯少于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。
　　 3

13、.TREM-2對小鼠成纖維細(xì)胞凋亡的影響
　　 (1)pEGFP-N1和pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠成纖維細(xì)胞后，Real-time PCR檢測顯示pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的小鼠成纖維細(xì)胞TREM-2 mRNA表達(dá)明顯高于pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。
　　 (2)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠成纖維細(xì)胞G1期百分比（70.88％±1.17％）

14、高于pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（67.13％±1.35％），且pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠成纖維細(xì)胞的凋亡率（0.96％±0.16％）大于pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.66％±0.05％）。PI染色結(jié)果表明:LPS處理可顯著增加成纖維細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比，而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（23.67％±8.08％）中凋亡細(xì)胞的百分比明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（

15、59.33％±17.34％）(P＜0.01)。
　　 (3)與正常對照組相比，LPS應(yīng)激的小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9 mRNA表達(dá)升高，而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8和caspase9mRNA表達(dá)明顯低于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。LPS應(yīng)激的小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8及c

16、aspase9活性均顯著強(qiáng)于正常對照組，而LPS+pEGFP-N1/TREM-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的小鼠成纖維細(xì)胞caspase3、caspase8及caspase9活性均弱于LPS+pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。
　　 4.VIP對ALI時TREM-2的表達(dá)調(diào)控
　　 (1) pGC-FU-VIP重組慢病毒構(gòu)建成功后，熒光顯微鏡觀察到肺內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度與pGC-FU-VIP重組慢病毒滴度呈正相關(guān)。RT-PCR檢

17、測顯示ALI小鼠肺組織VIP mRNA表達(dá)升高，而感染pGC-FU-VIP重組慢病毒的ALI小鼠肺組織中VIP mRNA表達(dá)明顯高于ALI組及感染pGC-FU慢病毒的ALI小鼠(P＜0.01)。
　　 (2)與正常對照組相比，ALI組小鼠肺組織TREM-2 mRNA表達(dá)降低，而VIP可增加ALI組小鼠肺組織TREM-2 mRNA表達(dá)(P＜0.01)。不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7和10-6 mol/L)的VI

18、P對靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞TREM-2表達(dá)無明顯影響(P＞0.05);VIP(10-8mol/L)處理后不同時間點(diǎn)(0、2、4、6、12和24 h)巨噬細(xì)胞TREM-2mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);VIP可呈劑量和時間依賴性上調(diào)LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示VIP對靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞TREM-2表達(dá)無明顯影響，但可增加LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)(P＜0.01)。

19、r>　　 (3) RT-PCR檢測表明VIP受體拮抗劑可減少VIP對LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:與LPS+VIP組相比，LPS+VIP+VIP受體拮抗劑組巨噬細(xì)胞TREM-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05);與LPS+VIP組相比，信號通路阻斷劑H-89和PD98059可降低巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 (4)通過JASPAR和IFTI數(shù)據(jù)庫對調(diào)控小鼠

20、肺內(nèi)TREM-2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示AP1和NF-κB可能是調(diào)控TREM-2表達(dá)的核心轉(zhuǎn)錄因子;Real-time PCR檢測表明VIP可增加LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞AP1 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:采用NF-κB抑制劑可增加LPS應(yīng)激的巨噬細(xì)胞TREM-2的平均熒光強(qiáng)度(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.AM表達(dá)TREM-1、TREM-3、TLT-1、TLT-2及

21、TLT-4，在ALI時表達(dá)均增加;而TREM-2廣泛表達(dá)于AM、成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞等多種肺系細(xì)胞，在ALI時表達(dá)降低。
　　 2.TREM-2可抑制LPS應(yīng)激的AM中NF-κB的活化，影響AM的激活，進(jìn)而切斷早期炎癥的啟動和放大。
　　 3.TREM-2可抑制死亡受體和線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，減少LPS應(yīng)激的成纖維細(xì)胞的凋亡，維持成纖維細(xì)胞數(shù)量和功能的動態(tài)平衡，有利于受損肺組織的及時修復(fù)。