采用RNAi技術抑制Colo-16細胞EGFR表達及其誘導凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:構建靶向EGFR短發(fā)夾RNA(shRNA)重組質粒載體并轉染人皮膚鱗狀細胞癌細胞株Colo-16細胞,觀察其轉染效率及對EGFR基因mRNA和蛋白表達的抑制效應,篩選出能高效且特異阻斷EGFR基因表達的重組質粒載體。將此高效重組質粒載體轉染Colo-16細胞,觀察Colo-16細胞對雷帕霉素敏感性的變化及Colo-16細胞凋亡的變化并探討其可能機制。
　　 方法:
　　 第一部分:靶向EGFR基因shRNA干擾載體

2、的構建與鑒定根據(jù)RNA干擾原理,體外設計并合成4對靶向EGFR基因shRNA,即shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4;以pGPU6/GFP/Neo質粒為載體,分別構建pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA2、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA3、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA4,轉化入JM109大腸桿菌,提取質粒,進行酶切和測

3、序鑒定;分別以Lipofectamine2000介導轉染皮膚鱗狀細胞癌Colo-16細胞,采用流式細胞術測定轉染效率;收集轉染48小時后的Colo-16細胞提取總RNA和總蛋白,RT-PCR和Western blot技術分別檢測EGFR基因mRNA及蛋白表達水平,計算抑制率,篩選有效靶點。
　　 第二部分: EGFR-shRNA增強Colo-16細胞對雷帕霉素敏感性和誘導Colo-16細胞凋亡的實驗研究將篩選出的重組質粒載體pG

4、PU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1轉染Colo-16細胞,采用四甲基偶氮唑藍法(MTT)測定Colo-16細胞對雷帕霉素敏感性的變化;流式細胞術檢測Colo-16細胞凋亡率,Hoeehst33258熒光染色觀察Colo-16細胞凋亡形態(tài)學改變;Westem blot檢測EGFR、Akt、NF-κB的表達變化。
　　 結果:
　　 第一部分:靶向EGFR基因shRNA干擾載體的構建與鑒定酶切結果表明,所有質粒均

5、為陽性重組質粒,測序的堿基序列與設計合成的堿基序列完全一致,證實shRNA能準確完整地導入質粒pGPU6/GFP/Neo。流式細胞術測定重組質粒對Colo-16細胞的轉染效率為38.28％。RT-PCR和Western blot結果顯示,與正常對照組相比,除pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA2對EGFR基因mRNA和蛋白表達水平無明顯抑制作用以外,其它重組質粒對EGFR基因mRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用(p＜0.05

6、),其中pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1的抑制作用最強,對EGFR基因mRNA和蛋白抑制率分別為63.35％和55.5％。
　　 第二部分: EGFR-shRNA增強Colo-16細胞對雷帕霉素敏感性和誘導凋亡的實驗研究pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNAl重組質粒載體轉染Colo.16細胞后,Colo-16細胞對雷帕霉素的敏感性提高了2.44倍,細胞凋亡率達(12.65±0.091)％,與空白組相

7、比,差異有顯著性(p＜0.05)。Hoechst33258熒光染色顯示Colo-16細胞核染色質出現(xiàn)凝聚、邊集、核裂解等形態(tài)學改變。Western blot檢測表明轉染后Colo-16細胞EGFR、Akt、NF-κB的表達顯著下調。
　　 結論:本研究成功構建并篩選出1個高效且特異阻斷EGFR基因表達的RNA干擾重組質粒表達載體pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1,對Colo-16細胞具有較高轉染效率。pGPU6/