轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠和豬的制備及基因功能研究.pdf

1、繁殖性狀是影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的重要經(jīng)濟性狀之一，其中產(chǎn)仔數(shù)是衡量母豬繁殖性狀的一個重要指標。提高產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵在于降低豬胚胎/胎兒死亡率，提高胎兒存活率。而胚胎死亡絕大多數(shù)發(fā)生在胚胎附植前或附植期間，因此胚胎附植是影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵時期。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子HOXA10基因（同源異形框A10基因）受雌激素、孕激素調(diào)控，高表達于著床窗口期，對胚胎附植的建立、妊娠的維持等具有重要作用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備特定時期在特異組織中高表達HOXA10基因的轉(zhuǎn)

2、基因動物，降低胚胎死亡，提高產(chǎn)仔數(shù)是我們努力的目標。
　　本研究通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型積累實驗數(shù)據(jù)，為制備高繁殖力轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ);通過轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，以期獲得高繁殖潛力的轉(zhuǎn)基因克隆豬，獲取新的科研材料;深入了解HOXA10基因在胚胎發(fā)育和附植過程中的調(diào)控機理，對于提高母豬產(chǎn)仔數(shù)具有重要的理論和實踐意義。
　　本研究主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用顯微注射法制備轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠，通過Southern及外源插入片段的全

3、長擴增對G0代陽性小鼠進行鑒定。對G2代陽性小鼠的各組織中Hoxa10基因的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)在腎臟、膀胱和子宮內(nèi)膜組織中有表達，在心臟、脾臟和卵巢中有痕量表達。G2代母鼠腹腔注射雌激素、孕激素來誘導Hoxa10基因表達，使用Q-PCR及Westernblot檢測Hoxa10表達的差異，并用Q-PCR檢測受Hoxa10調(diào)控的下游基因:ETA（內(nèi)皮素受體A）和Phgdh（磷酸甘油酸脫氫酶），發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達具

4、有差異。統(tǒng)計分析經(jīng)產(chǎn)胎次的G2代小鼠產(chǎn)仔數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠比非轉(zhuǎn)基因小鼠提高產(chǎn)仔數(shù)約1只(P=0.08)，可以認為轉(zhuǎn)HOXA10基因小鼠的產(chǎn)仔數(shù)有增加的趨勢。
　　2.對實驗室前期獲得的6頭G0代轉(zhuǎn)HOXA10基因克隆公豬進行傳代，產(chǎn)生了56頭G1代小豬，經(jīng)檢測有25頭為陽性，其中11頭雌性。檢測G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬12個組織中HOXA10的表達情況。結(jié)果顯示:HOXA10基因在腎臟、大腸和膀胱中的表達較高;肌肉和淋巴有微弱表達;

5、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、脂肪、小腸和睪丸中未檢測到表達。
　　3.對4頭G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬及部分G1代豬（陽性和陰性）進行血液生理生化指標測定，發(fā)現(xiàn)G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬及G1代公豬（陽性與陰性）血小板數(shù)目均低于非轉(zhuǎn)基因公豬和文獻報道的血小板數(shù)目。生化指標中，G0代轉(zhuǎn)基因克隆公豬的睪酮含量低于非轉(zhuǎn)基因公豬，其它指標沒有發(fā)現(xiàn)異常。
　　4.通過對豬胎兒成纖維細胞進行性別鑒定、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染pc3.1-PF3-HOXA10表達載

6、體、G418篩選、單克隆挑選、PCR檢測，建立了4株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOXA10的陽性細胞系。
　　5.利用胚胎移植技術(shù)，核移植其中1株生長狀態(tài)較好的細胞，成功制備了3頭轉(zhuǎn)HOXA10基因克隆母豬。采用Q-PCR和染色體步移技術(shù)對轉(zhuǎn)基因克隆母豬的外源基因拷貝數(shù)及整合位點進行檢測，發(fā)現(xiàn)3頭豬的拷貝數(shù)分別為27.70、19.88、25.26，外源片段可能插入到4號、9號、13號、14號染色體上。
　　6.采用LncRNA芯片，分析在Is

7、hikawa細胞（子宮內(nèi)膜癌細胞株）中過表達HOXA10基因后，引起差異表達的mRNA和LncRNA。發(fā)現(xiàn)過表達HOXA10基因后，有339個mRNA上調(diào)表達，568個mRNA下調(diào)表達(FoldChange≥2，P＜0.05及Q＜0.05)。對過表達HOXA10基因后差異表達的mRNA進行GO分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達的mRNA主要參與血管發(fā)育、細胞粘附、細胞遷移等生物過程;下調(diào)表達的mRNA主要參與細胞周期、胞內(nèi)運輸、蛋白核定位等生物過程。進

8、行KEGG通路分析時，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要涉及細胞粘附分子、細胞周期等生物學通路。
　　7.對LncRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)過表達HOXA10基因后，引起732個LncRNA上調(diào)表達，294個LncRNA下調(diào)表達（FoldChange≥2，P＜0.05及Q＜0.05）。對全部LncRNA進行亞組分析，共檢測到1，514條類似增強子的LncRNA，其中有43條上調(diào)表達，16條下調(diào)表達。在9，987條基因問長鏈非編碼RNA中，有274條上