轉(zhuǎn)CD14基因shRNA小鼠模型的制備.pdf

1、CD14為白細胞分化抗原14，是革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素LPS的高親和受體。CD14能夠識別且結(jié)合LPS，參與革蘭氏陰性菌的消化和吞噬作用，觸發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。為研究CD14基因在體內(nèi)的表達抑制對相關(guān)基因表達及動物個體發(fā)育影響、建立抗革蘭氏陰性菌小鼠模型，本研究利用已篩選并進行抑制效果驗證的CD14基因shRNA片段，構(gòu)建真核表達載體，通過原核注射法制備轉(zhuǎn)CD14基因shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠，對轉(zhuǎn)基因小鼠進行分析鑒定。鑒于真核表達載體制備轉(zhuǎn)基因

2、動物效率不高的問題，本研究還初步探討了慢病毒載體法制備轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)影響因素及其對轉(zhuǎn)基因效率的影響，為高效制備慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠奠定基礎(chǔ)。
　　 1.原核注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)CD14基因shRNA小鼠模型
　　 選擇已篩選并進行抑制效果驗證的CD14基因shRNA片段，將其連接插入pSlience4.1-CMV neo載體中，同時連接插入hEF1a-EGFP-IRES-neo-pA片段，構(gòu)建真核表達載體pSilencer4.

3、1-CD14 shRNA-IRES。采用原核注射的方法得到37只原代小鼠（F0代），經(jīng)PCR鑒定，3只為轉(zhuǎn)基因陽性鼠。通過擴繁獲得33只F1代小鼠，經(jīng)PCR、Southern-blotting檢測發(fā)現(xiàn)，11只為轉(zhuǎn)基因陽性。采用組織切片法，對F1代部分小鼠的主要臟器進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源轉(zhuǎn)EGFP標記蛋白在肝臟、腎和脾臟表達，且在脾臟的表達量最高。說明獲得的為嵌合體轉(zhuǎn)基因小鼠。采用實時熒光定量PCR方法檢測F1代轉(zhuǎn)基因小鼠CD14基因

4、的表達，結(jié)果顯示，相對于陰性小鼠，CD14基因在轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的心、肝、脾、肺、腎組織表達分別降低了8倍、3倍、19.5倍、6倍和11倍，表明轉(zhuǎn)基因陽性小鼠體內(nèi)，CD14基因shRNA對部分組織中的CD14基因表達具有顯著的抑制作用。
　　 2.CD14基因shRNA慢病毒載體對小鼠胚胎發(fā)育及轉(zhuǎn)基因效率的影響
　　 采用兩種水牛CD14基因shRNA的慢病毒表達載體pSicoR-GFP-buffalo-U6-shRNA、

5、pSicoR-GFP-human-U6-shRNA，通過卵周隙注射法探討病毒滴度、注射時期、不同U6啟動子的慢病毒載體對小鼠胚胎發(fā)育及轉(zhuǎn)基因效率的影響。結(jié)果顯示:1×106 IU/mL～1×109 IU/mL滴度的病毒均能感染小鼠胚胎，4組間胚胎的分裂率無顯著差異(P＞0.05)，1×106 IU/mL、1×107IU/mL、1×108 IU/mL組的囊胚率也無顯著差異(P＞0.05)，1×109 IU/mL組的囊胚率顯著低于其他三組(

6、P＜0.05)，各組囊胚轉(zhuǎn)EGFP基因陽性率差異顯著(P＜0.05)，感染小鼠胚胎較合適的慢病毒滴度為1×108 IU/mL。當用慢病毒感染1-細胞和2-細胞期胚胎時，兩組間的胚胎分裂率、囊胚率、囊胚陽性數(shù)均無顯著差異(P＞0.05)，2-細胞注射組的胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚陽性數(shù)均比注射1-細胞組的高，表明注射小鼠胚胎的較佳時期以2-細胞期較好。采用水牛源U6和人源U6啟動子病毒注射1-細胞期小鼠胚胎時，兩組間的胚胎卵裂率、囊胚率和囊

7、胚陽性率均無顯著差異(P＞0.05)，但人源U6啟動子組的囊胚陽性率高于水牛源U6啟動子組(96.4％ VS83.5％)。兩種U6啟動子注射組所得囊胚的EGFP表達實時熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人源U6組囊胚的EGFP表達量是水牛源U6組的5.6倍，表明含有人源U6的慢病毒載體結(jié)構(gòu)的整合效率高于水牛源U6的慢病毒載體結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論:原核注射法獲得的CD14基因shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠可穩(wěn)定遺傳外源基因，其內(nèi)源CD14基因表達顯