一個先天性遺傳性白內障家系的致病基因及蛋白質功能改變的研究.pdf

1、先天性白內障是指出生后第一年發(fā)生的晶狀體部分或全部混濁。我國群體發(fā)病率為0.05％，在歐美國家兒童發(fā)病率為0.01-0.06％，新生兒發(fā)病率為0.022-0.0249％。先天性白內障占兒童失明原因的第二位，全世界約10％盲童因而致盲。遺傳和宮內感染等諸多因素都可引起先天性白內障。遺傳性白內障占先天性白內障的比例可達25％。先天性白內障具有明顯的臨床和基因異質性，臨床上先天性白內障可表現為核性、前極、后極等形態(tài)各異的晶狀體混濁。從遺傳學角

2、度，先天性白內障又可表現為常染色體顯性遺傳，常染色體隱性遺傳和伴性連鎖遺傳。除此之外，一些先天性白內障還可合并其他系統(tǒng)的疾患，以綜合征的形式表現出來。
　　先天性白內障無論從臨床表現還是從遺傳基因角度均存在明顯的異質性，這種異質性表現為不同致病基因決定同一臨床表型，而同一基因的相同突變卻可引起不同的疾病表型。正是由于這種異質性的存在，表型與基因型之間的關系又是有限的，每種致病基因突變所導致的白內障占全部遺傳性白內障的比例都很小，所

3、以目前仍有多個未知致病基因有待發(fā)現，先天性白內障的臨床及分子發(fā)病機制尚未完全了解。
　　論文的第一部分我們通過基因序列分析的方法對一個常染色體顯性遺傳的先天性白內障家系進行突變篩查，對家系患者進行詳細的臨床檢查，排除眼部及仝身其他疾患。提取家系成員外周血DNA，根據家系特征性的前極Y字縫晶體核性混濁的臨床表型，對與該臨床表型關系最為密切的致病基因CRYGD，CRYGC，設計相關引物，經PCR擴增目的條帶后，直接測序。結果在CRYG

4、D基因第3外顯子第452堿基處發(fā)現了插入突變，c.452InsGACT，插入的四個堿基直接導致了堿基的移碼，編碼的相應蛋白第151位酪氨酸變?yōu)榻K止密碼，蛋白轉錄的提前終止。根據SNP數據庫，排除單核苷酸多態(tài)性。檢索人類基因突變數據庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，確定此改變?yōu)镃RYGD基因未見報道的新突變。對家系內所有成員以及100個無關健康個體進行驗證，結果表明所有健康個體均不攜帶該突變

5、，明確了基因型和臨床表型之間的關系。迄今為止，關于CRYGD基因的相關報道大多數為單堿基的錯義突變（包括R15C，P24T，R37S，R59H，E107A，W157X等），目前僅有一例報道為單堿基的缺失造成移碼突變(G165fs)。我們的研究第一次發(fā)現了因為CR YGD基因的堿基插入所導致的移碼突變。為先天性白內障的基因診斷提供依據。
　　論文的第二部分在發(fā)現家系致病基因CRYGD Tyr151X的基礎上，運用克隆技術，利用人類多

6、組織cDNA文庫卵巢組織，克隆CRYGD的野生型質粒。利用PCR介導的定點突變技術，克隆突變型質粒。在完成表達載體構建后，對重組表達載體進行了測序，測序的結果顯示野生型和突變型重組表達載體都表達成功，這為分析突變所致白內障分子機理的研究提供了基礎。利用Swiss-modelSoftware(Version3.7)、 Expasy、Radar等網絡蛋白質軟件，分析CRYGD基因突變型和野生型，把野生型和突變型的DNA序列信息分析的源頭，利

7、用基因組編碼區(qū)的信息進行蛋白質空間結構的模擬和蛋白質功能的預測?？赡軓囊韵聨讉€方面的變化，導致白內障的發(fā)生:1、突變后等電點的變化影響晶狀體細胞內的PH值。生理條件下晶狀體細胞內PH值為7.0，野生型的CRYGD等電點也為7.0，這意味著CRYGD蛋白將不帶電荷，均勻的分布在晶狀體纖維細胞中，從而保持晶狀體的透明性;突變后，等電點下降為6.05，影響晶狀體蛋白電荷性質，蛋白質間異常的靜電作用，可能會使其相互聚集，產生沉淀，影響晶狀體蛋白

8、的正常排列，導致白內障的產生。2、功能結構域變短突變使轉錄提前終止，第四個晶體結構蛋白Greek Key序列129-171提前終止，缺失24個氨基酸，整個CRYGD蛋白質的功能結構域變短，可能影響到蛋白質的正確折疊。3、蛋白質的內部的重復性的變化目前認為蛋白質內部重復片段在蛋白質序列進化的過程中具有重要意義，許多大的蛋白質通過內部復制進行進化，所以蛋白質內部的重復性與其功能和內部結構單位相關。Tyr151X突變使得蛋白質的內部的重復性發(fā)

9、生改變，可能進而影響到蛋白質的功能。4、蛋白質的三級結構變化將CRYGD及其突變序列分別輸入Swiss-model，數據庫將序列與蛋白質結構數據庫中的蛋白質三維結構進行匹配，輸回三維圖像。從三維結構上看，突變后該蛋白缺失了一個alpha螺旋和一段beta折疊，屬于非常劇烈的突變?？梢灶A計突變后立體結構不穩(wěn)定，很可能生物學功能也將喪失。
　　為了進一步研究CRYGD基因突變導致先天性白內障的分子機制，論文的第三部分中運用基因工程技術

10、，在真核細胞中分別表達外源性CRYGD正常和突變型質粒，對其蛋白的表達定位和抗凋亡功能等進行研究，結果顯示，野生型CRYGD蛋白在胞漿和細胞核中均有表達，突變型CRYGD蛋白在細胞核中表達且分布得很不均勻，呈顆粒聚積狀態(tài)。流式細胞儀檢測結果顯示，轉染突變型質粒的293T細胞更容易凋亡。在Western Blot實驗中野生型細胞蛋白全部在裂解的細胞上清中表達，而沉淀物中未見任何表達，而突變型只有少部分在裂解的細胞上清中表達，大部分在沉淀物

11、中表達;野生型所表達的蛋白片段大小基本與CRYGD大小一致，而突變型所表達的蛋白片段有所變小;提示突變可能使基因的轉錄提前終止，CRYGD蛋白變小，溶解度降低。
　　研究結果表明：
　　1、在對一常染色體顯性遺傳Y字縫型先天性白內障家系的致病基因研究中發(fā)現了CRYGD基因的一個新的突變位點——Tyr151X。這是迄今為止有關CRYGD基因所致突變中唯一的插入所導致的移碼突變。
　　2、成功構建了CRYGD基兇的野生型和