梅葉冬青對糖尿病創(chuàng)傷保護(hù)體內(nèi)外活性初步研究.pdf

1、目的:
　　1觀察梅葉冬青提取物對HUVEC細(xì)胞增殖以及遷移作用。
　　2檢測梅葉冬青提取物抗高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。
　　3初步觀察梅葉冬青軟膏劑對大鼠糖尿病創(chuàng)面潰瘍愈合效果。
　　4通過病理切片HE染色以及膠原三色染色驗(yàn)證梅葉冬青提取物對創(chuàng)面肉芽組織及膠原生成情況。
　　5通過免疫組化CD31，CD68和TGF-β1驗(yàn)證梅葉冬青提取物對組織炎癥細(xì)胞浸潤及誘導(dǎo)新生血管生成的作用。
　　方法:

2、　　1給予HUVEC細(xì)胞梯度濃度的梅葉冬青提取物處理后，以MTT法測定各組HUVEC細(xì)胞增殖率，通過經(jīng)典細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測梅葉冬青對細(xì)胞遷移的作用。
　　2將HUVECs分別在生理濃度葡萄糖NG(5mmol/L)和高糖HG(30mmol/L)條件下培養(yǎng)后Hoechest33258染色后熒光染色法，定性觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測抗高糖誘導(dǎo)凋亡。
　　3通過采用腹腔注射STZ（鏈

3、脲佐菌素）誘導(dǎo)SD雄性大鼠Ⅰ型糖尿病造模。將大鼠隨機(jī)分為正常組和糖尿病組。糖尿病組又隨機(jī)分為5％給藥組、10％給藥組、陰性對照組和莫匹羅星陽性對照組，通過比較造糖模組與正常組體重與血糖值的差別來驗(yàn)證造模成功與否。后剪去大鼠背脊兩側(cè)直徑1.8cm的圓形全層皮膚造局部潰瘍模型。
　　4在糖尿病潰瘍模型的基礎(chǔ)上給予相應(yīng)給藥處理，之后于第7天，第14天，第21天定期對創(chuàng)面進(jìn)行拍照并比較各組潰瘍愈合率差異。
　　5在Ⅰ型糖尿病潰瘍造模

4、成功后各組相應(yīng)給藥的基礎(chǔ)上，以CD31抗體特異性顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞觀察微血管陽性表達(dá)的改變，并通過對生物分子CD68，Masson膠原的陽性表達(dá)試圖解釋梅葉冬青對糖尿病潰瘍提高細(xì)胞增殖能力而形成肉芽組織，促進(jìn)膠原蛋白重塑，誘導(dǎo)血管生成增殖分化的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1在細(xì)胞活性檢測MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)中，增殖率以及細(xì)胞遷移率結(jié)果顯示在25μg/mL-100μg/mL劑量范圍內(nèi)梅葉冬青對HUVECs有增殖效應(yīng)及促細(xì)

5、胞遷移作用，與細(xì)胞對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，且在劑量范圍內(nèi)隨著藥物濃度增加，量效關(guān)系較為顯著。
　　2抗凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，Hoechest33258染色顯示梅葉冬青提取物可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化;亦可減少凋亡引發(fā)的細(xì)胞核碎裂;AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀定量檢測陰性對照組細(xì)胞早期及中晚期細(xì)胞凋亡率顯著升高，而給予梯度濃度梅葉冬青提取物處理后凋亡率相應(yīng)減少（P＜0.05）。
　　3梅葉冬青軟

6、膏高低劑量治療組的創(chuàng)面愈合明顯比空白對照組快(P＜0.05)，且高劑量組創(chuàng)面愈合較低劑量愈合更佳。
　　4病理切片HE染色及免疫組化染色的結(jié)果表明4個組中10％梅葉冬青軟膏給藥組在促進(jìn)創(chuàng)面愈合，加快膠原合成，增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)的陽性表達(dá)，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白陽性表達(dá)上效果最好。
　　結(jié)論:
　　1梅葉冬青對體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖、遷移及高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，