SRF–microRNA–143-145–TPM4通路在高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用研究.pdf

1、腹膜在高糖透析液的長(zhǎng)期刺激下，可以引起結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致超濾失敗，使尿毒癥病人不得不放棄腹膜透析治療，轉(zhuǎn)向其他腎臟替代治療。腹膜纖維化是超濾失敗的主要原因之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子，血清反應(yīng)因子（serum response factor,SRF）在高糖刺激后的HPMCs中表達(dá)增加，并且具有促進(jìn)高糖刺激所誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用。但是，其究竟是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控人腹膜間皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，目前未見相關(guān)研究報(bào)道。

2、　　miRNA是一種小的、非編碼RNA,主要是通過(guò)抑制其靶基因，而發(fā)揮其生物學(xué)作用。很早以前科學(xué)家們就發(fā)現(xiàn)了miRNA的存在，但是一直認(rèn)為其是伴隨基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，生成的“垃圾”產(chǎn)物，并無(wú)任何實(shí)質(zhì)性的功能。自從1993年哈佛大學(xué)的Lee RC教授，首次報(bào)道了miRNA具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用后，越來(lái)越多的研究表明，其在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、細(xì)胞增殖及凋亡，以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，發(fā)揮著重要的作用。
　　文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-143/14

3、5在多種腫瘤組織中的表達(dá)降低，并且與其侵襲和轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。我們課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高糖刺激后的人腹膜間皮細(xì)胞中，其表達(dá)量明顯增加。那么，它們是否參與了人腹膜間皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換呢？迄今為止，并不是很清楚。
　　TPM4是原肌球蛋白家族中的一員，目前對(duì)其研究甚少。我們發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激后腹膜間皮細(xì)胞中，TPM4蛋白的表達(dá)明顯降低。這提示TPM4可能在腹膜間皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中，發(fā)揮一定的作用。
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)TPM4

4、是miRNA-143/145下游靶基因之一，并且在細(xì)胞系中，它們的表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系。那么，miRNA-143/145和TPM4是否參與了高糖刺激所誘導(dǎo)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換？他們二者是否能夠結(jié)合，又是如何結(jié)合？這些問(wèn)題將是本課題的研究重點(diǎn)。
　　目的：
　　1.觀察miRNA-143/145和TPM4在高糖刺激后的腹膜間皮細(xì)胞中的表達(dá)情況及其功能；
　　2.驗(yàn)證miRNA-143/145和TPM4之間的關(guān)系；
　　3.

5、驗(yàn)證SRF和miRNA-143/145之間的關(guān)系；
　　方法：
　　1.利用D型葡萄糖刺激人腹膜間皮細(xì)胞，通過(guò)western blot和qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)miRNA-143/145和TPM4的表達(dá)情況；
　　2.利用miRNA-143/145 mimic和inhibitor進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，建立過(guò)表達(dá)和功能抑制細(xì)胞系，觀察其在細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；
　　3.TPM4慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建立過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞系，觀察其

6、在細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；
　　4.聯(lián)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miRNA-143/145的靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證；
　　5.SRF慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建立過(guò)表達(dá)和功能缺失細(xì)胞系，觀察miRNA-143/145的表達(dá)變化；
　　結(jié)果：
　　1.miRNA-143/145在高糖刺激后的HPMCs中的表達(dá)增加，并且其具有促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用
　　利用50mmol/LD-型葡萄糖刺激HPMCs，通過(guò)qRT-PC

7、R檢測(cè)miRNA-143/145的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-143/145的表達(dá)增加，并且具有時(shí)間依賴性；隨后，通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-143/145 mimic和inhibitor，證明了miRNA-143/145具有促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用。
　　2.TPM4蛋白在高糖刺激后的HPMCs中的表達(dá)降低，并且其具有抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用
　　Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示，高糖刺激可以降低其蛋白的表達(dá)，但不影

8、響其mRN A的表達(dá)，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，分別建立了過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)其具有抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用。
　　3.miRNA-143/145和TPM4蛋白在高糖刺激后的HPMCs中表達(dá)負(fù)相關(guān)，并且二者可以結(jié)合
　　綜合上述1和2的western blot和qRT-PCR結(jié)果表明，高糖刺激后，miRNA-143/145和TPM4蛋白的表達(dá)負(fù)性相關(guān)，但是其mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化；聯(lián)合Targetscan、MicroCosm和m

9、iRbase三個(gè)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)，TPM4為miRNA-143/145下游靶基因之一，利用了雙熒光素酶報(bào)告基因，證實(shí)miRNA-143/145可以與TPM4 3'-UTR相結(jié)合4.SRF可以正向調(diào)控miRNA-143/145的表達(dá)
　　通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，我們建立了SRF過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞模型，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-143/145的表達(dá)，結(jié)果提示，SRF可以調(diào)控miRNA-143/145的表達(dá)，表明細(xì)胞體

10、內(nèi)存在SRF-miRNA-143/145-TPM4信號(hào)軸。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)對(duì)高糖刺激后的HPMCs中SRF、miRNA-143/145和TPM4表達(dá)的研究，我們證實(shí)了高糖刺激后，HPMCs中miRN A-143/145的表達(dá)增加，其上游受到SRF的調(diào)控，其下游調(diào)控TPM4蛋白水平的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換。因此，SRF-miRNA-143/145-TPM4這條新的信號(hào)軸存在于高糖刺激的HPMCs中，這對(duì)于進(jìn)一步了解