霍山石斛離體培養(yǎng)物生物堿合成的生理與分子機(jī)制研究.pdf

1、霍山石斛（Dendrobium huoshanense），是蘭科石斛屬植物，不僅具有較高的觀賞價(jià)值，其藥用價(jià)值也極高。本研究以霍山石斛原球莖、莖段和試管苗為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化，測定了不同離體培養(yǎng)條件下霍山石斛抗氧化酶活性和生物堿含量。同時(shí)以霍山石斛原球莖為材料，克隆了倍半萜類生物堿合成途徑中的兩個(gè)限速酶（3-羥基-3-甲基戊二酸單酰COA還原酶和法呢基焦磷酸合酶）基因—HMGR基因和FPS基因，并對不同離體培養(yǎng)條件處理下的HMG

2、R基因和FPS基因進(jìn)行定量表達(dá)分析。
　　1、霍山石斛離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　以霍山石斛離體培養(yǎng)的原球莖、莖段以及試管苗為材料，優(yōu)化霍山石斛原球莖增殖、不定芽誘導(dǎo)與增殖、試管苗生長與生根及移栽等離體培養(yǎng)條件。①以霍山石斛原球莖為材料，比較了不同基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、KT配合使用對原球莖增殖的影響，發(fā)現(xiàn)霍山石斛原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.2 mg/L+NAA0.1 mg/L+KT0.1 mg/L。另

3、外，試驗(yàn)還比較了不同光質(zhì)對霍山石斛原球莖增殖的影響，發(fā)現(xiàn)白光處理?xiàng)l件下其增殖效果最好，綠光處理下的效果最不理想。②采用了4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，比較了不同濃度的6-BA、NAA、2,4-D對霍山石斛不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，最適合霍山石斛不定芽誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)基均為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+2,4-D0.1 mg/L。③在霍山石斛試管苗生長和生根方面的研究，發(fā)現(xiàn)霍山石斛試管苗生長效果較好的情

4、況出現(xiàn)在NAA和IBA的添加濃度為0.5 mg/L以及香蕉勻漿物的濃度為200 g/L時(shí)。在該條件下，霍山石斛的生根狀況也相對較好。④試驗(yàn)還比較了不同移栽基質(zhì)對霍山石斛移栽成活率的影響，發(fā)現(xiàn)水草基質(zhì)中較適合霍山石斛移栽苗的生長。
　　2、不同離體培養(yǎng)條件下霍山石斛抗氧化酶活性和生物堿含量的測定
　　選取不同光質(zhì)處理下的霍山石斛試管苗為材料，比較了霍山石斛抗氧化酶活性和生物堿含量在不同光質(zhì)下的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，白光處理?xiàng)l件下

5、的SOD、POD、CAT活性均大于其它三組，而紅光處理?xiàng)l件下的SOD、POD、CAT酶活性均小于其它各組。生物堿合成對不同光質(zhì)的響應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，白光條件下生物堿含量明顯高于其它組，而綠光處理?xiàng)l件下生物堿含量較其它組別低，同時(shí)藍(lán)光條件下生物堿含量要高于紅光處理。
　　以不同茉莉酸甲酯處理下的霍山石斛原球莖作為測定材料，測定其抗氧化酶活性和生物堿含量。試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加200μmol/L茉莉酸甲酯后，不僅SOD、POD、CAT活性達(dá)到

6、最高值，生物堿含量同樣也出現(xiàn)最高值。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨茉莉酸甲酯濃度的提高，酶活性和生物堿含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。說明添加適當(dāng)濃度的茉莉酸甲酯不僅有利于抗氧化酶活性的提高，也可以促進(jìn)生物堿的合成和積累。
　　3、霍山石斛HMGR基因和FPS基因的克隆及其生物信息學(xué)分析
　　應(yīng)用同源克隆與RACE技術(shù)結(jié)合，以霍山石斛原球莖為材料，克隆獲得HMGR基因cDNA全長，序列全長2240 bp，共編碼562個(gè)氨基酸，在GenBank

7、上登錄，登錄號為KF011508。對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HMGR蛋白是一個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)的不穩(wěn)定的跨膜疏水蛋白，不具有信號肽，無卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，含有典型的HMG-CoA_reductase_class1保守結(jié)構(gòu)域。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白由α螺旋、無規(guī)則卷曲和β折疊組成，通過三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，進(jìn)一步驗(yàn)證了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)霍山石斛HMGR與黃姜HMGR的親緣關(guān)系比較近。
　　本研究同時(shí)克隆獲得了FPS基因2條cD

8、NA全長。一條全長為1587 bp，登錄號為KF891313.1；一條全長為1559 bp，登錄號為KF891314.1。這2條基因的cDNA序列的開放閱讀框一樣，均編碼348個(gè)氨基酸，該現(xiàn)象可能是由于Poly(A)多聚腺苷酸化導(dǎo)致的結(jié)果。對FPS蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的、不具有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)的親水蛋白。其有可能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，且在微體上定位的可能性較大，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于Isoprenoid_Biosyn_C

9、1超家族，含有典型的Trans_IPPS_HT保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白由α螺旋、無規(guī)則卷曲和β折疊組成，且三維結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)推測的一致。進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)霍山石斛在陸生植物這一分支。
　　4、霍山石斛HMGR基因和FPS基因定量表達(dá)分析
　　以18S rRNA為內(nèi)參基因，對HMGR基因和FPS基因在不同茉莉酸甲酯和不同光質(zhì)處理下及不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行定量表達(dá)分析。①HMGR基因在紅光和藍(lán)光處理?xiàng)l件下

10、的表達(dá)量較高，而綠光處理?xiàng)l件下的表達(dá)量明顯偏低。②FPS基因在白光和藍(lán)光處理?xiàng)l件下的表達(dá)量較高，而紅光和綠光處理?xiàng)l件下的表達(dá)量相對較低。③HMGR基因和FPS基因在在各個(gè)茉莉酸甲酯處理下都能檢測到，且隨茉莉酸甲酯添加濃度的升高，HMGR基因和FPS基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在200μmol/L茉莉酸甲酯處理下表達(dá)量最高。④在霍山石斛不同組織中HMGR基因的表達(dá)水平為莖>幼葉>根，F(xiàn)PS基因的表達(dá)水平為幼葉>莖>根。結(jié)合生物堿