丁苯酞對(duì)K141N突變型HSPB8蛋白致線(xiàn)粒體異常的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景:
　　腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth Disease，CMT)又稱(chēng)遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)性神經(jīng)病（hereditary motor and sensory neuropathy，HMSN）是一類(lèi)最常見(jiàn)的遺傳性周?chē)窠?jīng)病。臨床上依據(jù)其病理和電生理特點(diǎn)可分為三型:脫髓鞘型（CMT1型）、軸突型（CMT2型）和中間型(Intermediate CMT，ICMT)。我們通過(guò)定位候選基因克隆策略在致病基因定位區(qū)間發(fā)現(xiàn)

2、了小分子熱休克蛋白B8(HSPB8)基因的點(diǎn)突變(423G→T)導(dǎo)致氨基酸K141N替換，并最終通過(guò)共分離分析等研究表明其為CMT2L致病突變。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)K141N突變型HSPB8蛋白在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中引起線(xiàn)粒體的聚集，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)病人皮膚成纖維細(xì)胞中存在線(xiàn)粒體膜電位的異常。丁苯酞（dl-3-n-butylphthalide，NBP）與芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素的結(jié)構(gòu)相同，為其人工合成的消旋體。已

3、有研究證實(shí)NBP可以改善腦缺血區(qū)微循環(huán)、保護(hù)線(xiàn)粒體功能、增加神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體ATP酶活性以及減輕神經(jīng)功能損傷程度。所以我們推測(cè)丁苯酞可能會(huì)對(duì)K141N突變型HSPB8蛋白造成的線(xiàn)粒體異常有一定的保護(hù)作用。
　　研究目的:
　　進(jìn)一步研究K141N突變型HSPB8對(duì)線(xiàn)粒體的影響，同時(shí)使用NBP進(jìn)行干預(yù)，探討NBP對(duì)K141N突變型HSPB8致線(xiàn)粒體異常的保護(hù)作用。
　　研究方法:
　　(1)采用透射電鏡觀察攜帶K14

4、1N突變型HSPB8基因的CMT2L病人腓腸神經(jīng)內(nèi)線(xiàn)粒體分布情況。
　　(2)應(yīng)用CCK-8檢測(cè)不同濃度NBP對(duì)K141N突變型HSPB8蛋白誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力降低的保護(hù)作用。
　　(3)通過(guò)免疫熒光技術(shù)分別觀察給予10μmol/L NBP處理前后，感染了野生型和K141N突變型HSPB8蛋白的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起數(shù)目。
　　(4)采用透射電鏡分別觀察給予10μmol/L NBP處理前后，高表達(dá)野生型和K141

5、N突變型HSPB8蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體分布情況。
　　(5)采用流式細(xì)胞儀分別測(cè)量給予10μmol/L NBP處理前后，高表達(dá)野生型和K141N突變型HSPB8蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞，在受到H2O2損傷性刺激后線(xiàn)粒體活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生的情況。
　　結(jié)果:
　　(1)攜帶K141N突變型HSPB8基因的CMT2L病人腓腸神經(jīng)內(nèi)存在線(xiàn)粒體異常聚集。
　　(2) HSPB8 K141N突變后導(dǎo)致細(xì)

6、胞活力降低，給予不同濃度（1、10、100μmol/L）NBP處理后細(xì)胞活力增高，當(dāng)NBP濃度為10μmol/L時(shí)細(xì)胞活力明顯增高，給藥前后存在顯著差異(P＜0.001)。
　　(3)高表達(dá)K141N突變型HSPB8蛋白會(huì)減少脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起數(shù)目，給予10μmol/L NBP預(yù)處理，高表達(dá)K141N突變型HSPB8蛋白組神經(jīng)元突起數(shù)目增多，給藥前后存在顯著性差異(P＜0.01)。
　　(4)高表達(dá)K141N突變型HSPB8

7、蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞存在線(xiàn)粒體異常聚集，給予10μmol/L NBP預(yù)處理線(xiàn)粒體異常聚集情況有所改善。
　　(5)高表達(dá)K141N突變型HSPB8蛋白導(dǎo)致線(xiàn)粒體抗氧化損傷的能力降低，ROS生成量高于高表達(dá)野生型HSPB8蛋白的細(xì)胞，兩者存在顯著性差異(P＜0.05);給予10μmol/L NBP預(yù)處理，高表達(dá)K141N突變型HSPB8蛋白組細(xì)胞ROS生成量降低，給藥前后存在顯著性差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論: