HSPB8蛋白與NEFL蛋白相互作用研究及HSPB8蛋白對(duì)細(xì)胞相對(duì)活力的影響.pdf

1、腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)又稱為遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)性神經(jīng)病(Hereditary Motor and Sensory Neuropathy，HMSN)，是一組最常見(jiàn)的具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，以肢體遠(yuǎn)端肌肉進(jìn)行性對(duì)稱性的萎縮、腱反射減弱和遠(yuǎn)端感覺(jué)減退等為主要臨床特征，發(fā)病率約為40/10萬(wàn)。根據(jù)電生理和病理學(xué)特點(diǎn)，CMT可以分為脫髓鞘型(CMT1)和軸索型(CMT2)

2、，根據(jù)遺傳方式的不同，CMT可以分為常染色體顯性遺傳(AD)，常染色體隱性遺傳(AR)和X連鎖遺傳(XD/XR)。迄今為止，腓骨肌萎縮癥的分子遺傳學(xué)分型已達(dá)到29型，其中21型已克隆。最新研究表明，CMT2型的幾個(gè)亞型與小分子量熱休克蛋白(Small Heat Shock Proteins，sHSPs)基因以及神經(jīng)絲輕鏈(NeurofilamentLight Chain，NEFL)基因突變密切相關(guān)。2000年，Mersiyanova等在

3、1個(gè)俄羅斯CMT2E大家系中發(fā)現(xiàn)了NEFL基因的Q333P致病突變，從而證實(shí)NEFL基因?yàn)镃MT2E的致病基因；2004年，Evgrafov OV等在1個(gè)俄羅斯和1個(gè)比利時(shí)CMT2F大家系中分別發(fā)現(xiàn)了小分子量熱休克蛋白B1(heat shockprotein B1，HSPB1)基因的R127W和S135F致病突變，從而證實(shí)HSPB1基因?yàn)镃MT2F型的致病基因；2004年，我們將1個(gè)來(lái)自中國(guó)湖南和湖北常染色體顯性遺傳的CMT2大家系定位

4、在12q24.2-12q24.3，命名為CMT2L型，隨后通過(guò)候選基因排除克隆的方法，在該定位區(qū)間發(fā)現(xiàn)了小分子量熱休克蛋白B8(heat shock protein B8，HSPB8)的423G→T點(diǎn)突變，導(dǎo)致氨基酸K141N替換，從而證實(shí)HSPB8為CMT2L型的致病基因。 HSPB1和HSPB8屬于小分子量熱休克蛋白家族成員，研究發(fā)現(xiàn)HSPB8具有分子伴侶功能，可以穩(wěn)定細(xì)胞骨架，協(xié)助其正確組裝。NEFL是真核生物體內(nèi)的一種主

5、要的中間絲結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞骨架的重要組成部分。近年來(lái)，研究表明<'wt>HSPB8及<'K141N>HSPB8均可與HSPB1發(fā)生相互作用；而HSPB1和<'wt>NEFL之間也可能存在相互作用。但<'wt>HSPB8及<'K141N>HSPB8能否直接與<'wt>NEFL發(fā)生相互作用，目前尚不清楚。在本研究中，我們將前期工作中成功構(gòu)建的pEGFP-<'wt>HSPB8和pEGFP-<'K141N>HSPB8真核表達(dá)載體分別與PCI-<'w

6、t>NEFL真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光共定位技術(shù)初步研究了<'wt>HSPB8、<'K141N>HSPB8與<'wt>NEFL之間的相互作用，結(jié)果表明<'wt>HSPB8、<'K141N>HSPB8均與<'wt>NEFL存在共定位，即<'wt>HSPB8、<'K141N>HSPB8可能與<'wt>NEFL存在相互作用；隨后應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)，我們進(jìn)一步研究了<'wt>HSPB8、<'K141N>HSPB8與<'wt

7、>NEFL之間的相互作用，結(jié)果證實(shí)<'wt>HSPB8、<'K14N>HSPB8與<'wt>NEFL之間均存在相互作用。 為了解HSPB8在細(xì)胞受到致死性熱休克刺激時(shí)對(duì)細(xì)胞相對(duì)活力的保護(hù)作用及K141N突變對(duì)細(xì)胞相對(duì)活力影響的改變，我們利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將pEGFP-<'wt>HSPB8和pEGFP-<'K141N>HSPB8真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染SHSY-5Y細(xì)胞，通過(guò)MTT比色法探討了<'wt>HSPB8、<'K141N>H