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文檔簡介
1、布魯氏菌病是由感染人和動物的布魯氏菌造成的對社會安全有嚴(yán)重危害的疾病,在世界上廣泛流行,尤其是在發(fā)展中國家,造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌是一類兼性胞內(nèi)寄生菌,其毒力主要依賴于在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖的能力。二元調(diào)控系統(tǒng)(two-component regulatory system,TCS)能夠?qū)Νh(huán)境信號感受應(yīng)答、傳遞以及處理的信號進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)和控制。布魯氏菌有15對 TCS,已有研究表明,位于染色體 I的 TCS與布魯氏菌的毒力
2、密切相關(guān),但位于染色體 II的 TCS的毒力表型及其調(diào)控機(jī)制還尚不清楚。本研究以布魯氏菌 TCS TceSR和 TcfSR為研究對象,通過探討 TCS TceSR和 TcfSR對布魯氏菌毒力表型、相關(guān)基因表達(dá)和胞內(nèi)生存繁殖的影響,及其在小鼠體內(nèi)的毒力和免疫保護(hù)力,為揭示布魯氏菌感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制提供線索,也為新疫苗的研發(fā)、相關(guān)疫病的預(yù)防、控制和抗病育種工作提供依據(jù)。
目的:本研究以羊種布魯氏菌參考株16M為研究對象,探討
3、TCS TceSR和 TcfSR的功能及其在布魯氏菌致病過程中的作用機(jī)制。(1)構(gòu)建 TCS TceSR和 TcfSR啟動子失活的突變株,并對其進(jìn)行鑒定。(2)分析 TCS TceSR和 TcfSR突變株相關(guān)毒力基因的胞內(nèi)外轉(zhuǎn)錄水平,比較突變株和親本株毒力基因表達(dá)的差異,根據(jù)差異基因的功能及其在突變株中的轉(zhuǎn)錄變化,解釋突變株相關(guān)毒力表型的變化。(3)分析比較突變株和親本株胞內(nèi)生存相關(guān)表型的差異,確定 TCS TceSR和 TcfSR對布
4、魯氏菌胞內(nèi)存活的作用。(4)分析突變株在小鼠體內(nèi)的毒力,探討 TCS TceSR和 TcfSR對布魯氏菌在小鼠體內(nèi)建立慢性感染的作用。
方法:(1)利用同源重組和抗性替換的方法,構(gòu)建了 TCS TceSR和 TcfSR啟動子失活的突變株;對獲得的基因突變株進(jìn)行 PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性檢測。(2)布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7,qRT-PCR檢測布魯氏菌相關(guān)毒力基因(主要包括脂多糖合成相關(guān)蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)
5、運(yùn)系統(tǒng)、鞭毛系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)、壓力蛋白/泛素相關(guān)蛋白、氮源代謝分子)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平;親本株和突變株在體外刺激環(huán)境中培養(yǎng)30min。利用 qRT-PCR分析毒力基因 omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的轉(zhuǎn)錄變化。(3)比較突變株和親本株的胞內(nèi)存活相關(guān)表型。布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7,在侵染后不同時(shí)間,檢測細(xì)菌的黏附侵襲能力和胞內(nèi)存活能力;親本株和突變株侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7,利用熒
6、光定量 PCR、流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡測定宿主細(xì)胞在細(xì)菌的侵襲下所引起的凋亡和自噬水平;構(gòu)建能夠表達(dá)綠色熒光的布魯氏菌,侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7,觀察布魯氏菌與溶酶體的融合情況。(4)用布魯氏菌疫苗株和突變株分別腹腔接種免疫(106CFU)SPF級4-6周齡雌性 BALB/c小鼠;接種后的不同時(shí)間點(diǎn)采集免疫小鼠血清,采用間接 ELISA測定小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子 IFN-γ的水平和總的 IgG水平;無菌分離脾臟,測定脾臟載菌量,制備病
7、理切片,檢測突變株的毒力;用105CFU的16M進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),檢測各菌株的保護(hù)力;克隆、表達(dá)、純化 TCES和 TCFS兩個(gè)蛋白,以純化的蛋白作為抗原,分別對突變株免疫小鼠的血清進(jìn)行 Western Blot分析。
結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了 TCS TceSR和 TcfSR啟動子突變株16MΔTceSR和16MΔTcfSR,在15代內(nèi)遺傳性穩(wěn)定;突變株和親本株的體外生長趨勢一致;體外刺激結(jié)果顯示,突變株對酸、堿、高鹽、熱應(yīng)激、營
8、養(yǎng)缺陷和干燥的抵抗力降低。(2)親本株和突變株侵染細(xì)胞24h后,66個(gè)布魯氏菌相關(guān)毒力基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,其中在16MΔTceSR突變株中,41個(gè)(62.12%)基因高表達(dá),25個(gè)(37.88%)基因低表達(dá);在16MΔTcfSR突變株中,47個(gè)(71.21%)基因高表達(dá),19(28.79%)個(gè)基因低表達(dá);在體外刺激環(huán)境下,布魯氏菌胞內(nèi)存活相關(guān)的基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平均低于在親本株中的轉(zhuǎn)錄水平。(3)突變株對細(xì)胞的粘附能力和
9、胞內(nèi)存活能力是減弱的;細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn),突變株與親本株引起宿主細(xì)胞凋亡程度相似;而細(xì)胞自噬結(jié)果卻發(fā)現(xiàn),突變株引起細(xì)胞自噬水平低于親本株;溶酶體融合實(shí)驗(yàn)顯示,侵染細(xì)胞24h時(shí)突變株組胞內(nèi)的布氏小體與溶酶體融合率高于親本株組。(4)突變株免疫小鼠后,可誘導(dǎo)機(jī)體分泌 IFN-γ和 IgG,小鼠脾臟載菌量低于親本株,但仍存在一定的毒力;攻毒后,突變株免疫的小鼠對親本株可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力;布魯氏菌重組蛋白 TCES和 TCFS可以作為診斷抗原
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