糖尿病食療型轉(zhuǎn)基因黃瓜的研究.pdf

1、糖尿病（diabetes mellitus）是胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂，臨床以高血糖、高血脂、高粘血癥為主要標(biāo)志的全身慢性代謝性臨床綜合征。近年來，糖尿病本身及其并發(fā)癥對人們的身心健康危害重大，已經(jīng)成為現(xiàn)代流行疾病的第二殺手，僅次于癌癥對人類的危害。因此，尋找更好的糖尿病藥物和治療方法是人們致力攻克的一大難題。全世界糖尿病患者人數(shù)呈逐年上升，并向低齡化趨勢。隨著社會(huì)進(jìn)步和人們生活方式的變化

2、，糖尿病已成為威脅人類健康的重要慢性非感染性流行疾病。
　　 谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）是一種抑制神經(jīng)遞質(zhì)-γ-氨基丁酸（GABA）的合成酶，有研究認(rèn)為1型糖尿病的發(fā)病機(jī)理可能與細(xì)胞免疫有關(guān)，而GAD65很可能是此自身免疫反應(yīng)中的始動(dòng)靶抗原，因此通過抑制GAD65引起的特異性自身免疫反應(yīng)，即有可能預(yù)防和治療1型糖尿病。
　　 胰高血糖素樣肽-1（glucagon-lik

3、e peptide-1，GLP-1），又稱促胰島素激素，它是一種通過與胰島β細(xì)胞表面的特異受體相互作用而使葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌顯著增強(qiáng)的一種小肽。GLP-1還能減少胰島細(xì)胞損傷，改善胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)，修復(fù)胰島β細(xì)胞功能，促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生，提高胰島細(xì)胞活力并延長其壽命，抑制胰升糖素的釋放，調(diào)控胰腺β細(xì)胞特異基因表達(dá)并通過這種基因調(diào)控改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，提高β細(xì)胞對葡萄糖的反應(yīng)性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能。GLP-1被認(rèn)為是一種“治

4、標(biāo)治本”的糖尿病治療新物質(zhì)，對于糖尿病的治療具有重要意義。
　　 天然的GLP-1很快被體內(nèi)特異性二肽酶Ⅳ（DPPⅣ）降解而失活。本研究所使用的GLP-1基因在保證生物活性不受影響的前提下消除了二肽酶Ⅳ（DPPⅣ）位點(diǎn)和基因內(nèi)部的胰蛋白識別位點(diǎn)，使其可用于口服或食用。為綜合GAD和GLP分別對1型和2型糖尿病的預(yù)防和治療效果，并確保其食用后各自在體內(nèi)高效發(fā)揮作用，構(gòu)建融合基因時(shí)在GAD和GLP基因間添加了兩個(gè)胰蛋白酶的識別位點(diǎn)，

5、以保證食用后在腸道內(nèi)形成的有獨(dú)立活性的GAD和CLP多肽。
　　 本研究選用的載體是無抗生素選擇性標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體pX6，使用Marker-Free載體獲得無抗生素選擇性標(biāo)記的植物，可以消除公眾的安全性顧慮以及保證環(huán)境釋放的安全性。將構(gòu)建好的GAD-GLP-1融合基因克隆到表達(dá)載體pX6，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pX6-GAD-GLP-1，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌株，構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)化用的工程農(nóng)桿菌。對影響黃瓜子葉節(jié)經(jīng)器官發(fā)生途

6、徑誘導(dǎo)叢生芽形成和與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黃瓜頻率有關(guān)的重要因素進(jìn)行研究和優(yōu)化。結(jié)果表明黃瓜自交系2M1用4天苗齡的子葉節(jié)作為外植體，農(nóng)桿菌浸染15min，共培養(yǎng)2天，出芽率最高。
　　 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法和floral dip法對黃瓜自交系2M1和P2進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)PCR檢測及Southern斑點(diǎn)雜交檢測，共獲得15株含有外源基因GAD-GLP-1的轉(zhuǎn)基因植株。其中，農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化率為0.25％，花粉管通道法的轉(zhuǎn)化率為0

7、.1％，首次成功應(yīng)用在黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化中的floral dip法的轉(zhuǎn)化率為0.6％。
　　 將獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過β-雌二醇的誘導(dǎo)后，得到了Marker-free轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)行western blot分析，有2株植株呈陽性結(jié)果，分別命名為F22，A53。
　　 以A53植株為材料，將黃瓜果實(shí)粉碎，并提取總蛋白，其濃縮物溶解液和果實(shí)粉碎物溶解液分別灌喂高血糖Wistar大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)處理組口服給藥20天后，高血糖大鼠的血

8、糖值均有所下降，從23.8±9.5mM降低到13.2±2.4mM和12.9±2.8mM，而正常對照組和0.9％NaCl對照組的血糖值在實(shí)驗(yàn)前后均無明顯變化。表明通過給高血糖大鼠灌服GAD-GLP-1蛋白后，在體內(nèi)降解為GAD、GLP-1單體，并且被腸道部分吸收，在一定程度上能夠降低高血糖大鼠的血糖水平。同時(shí)也改善了模型大鼠的飲食、飲水平衡。
　　 為提高GLP-1在植物體內(nèi)的表達(dá)量，本研究首次將10拷貝的GLP-1基因片段克隆到