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文檔簡介
1、正常妊娠過程的維持依賴于完整而正常的胎盤功能。大量研究表明,子宮-胎盤組織特別是滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應激在子癇前期、胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒宮內(nèi)生長受限、流產(chǎn)等妊娠疾病的發(fā)病中起重要作用。因此,抗氧化物質(zhì)的治療作用也越來越受到重視。但是,由于大分子抗氧化物質(zhì)不易進入細胞以及高劑量小分子抗氧化劑反而會損害胎盤功能等缺點,構(gòu)建一個細胞穿透力強且高效富集、可控釋放的載藥系統(tǒng)來提高抗氧化劑治療效果是必要的。碳納米管(Carbon Nanotubes,CN
2、Ts)是由碳原子形成的一維中空管狀體。近年來,CNTs以其獨特的物理和化學性質(zhì)成為納米醫(yī)學甚至整個生物醫(yī)學領域研究的熱點,尤其是在載藥方面,CNTs更是具有許多獨特的優(yōu)良性質(zhì)。本研究中,首先通過研究不同濃度過氧化氫(H2O2)作用不同時間對人滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo氧化損傷水平的影響,確定建立人滋養(yǎng)細胞氧化應激模型的條件;其次,分別制備了小分子羧基和超氧化物歧化酶(SOD)功能化修飾的多壁碳納米管(MWNT-COOH和SOD-g
3、-MWNT),并對其物理化學特性及生物安全性進行了表征和研究;最后,在建立的滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo氧化應激模型基礎上,比較還原型谷胱甘肽(GSH)、MWNT-COOH+GSH和SOD-g-MWNT+ GSH這三者在提高HTR-8/SVneo細胞對氧化損傷的耐受性、改善細胞氧化損傷中所起的不同作用。旨在尋找一種能夠載送大分子抗氧化劑進入細胞、提高抗氧化劑治療效果同時減少其副作用的方法。
第一部分過氧化氫誘導人滋養(yǎng)細胞HT
4、R-8/SVneo氧化應激模型的建立
目的:通過研究不同濃度過氧化氫(H2O2)作用不同時間對人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo氧化應激水平的影響,確定建立滋養(yǎng)細胞氧化應激模型的條件。
方法:用不同濃度H2O2分別作用于HTR-8/SVneo不同時間,CCK-8法檢測細胞增殖,分光光度法檢測細胞培養(yǎng)上清液中SOD活性及LDH含量,流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)超氧陰離子含量以及細胞凋亡情況。
結(jié)果:從整體來看,H2O2
5、引起HTR-8/SVneo細胞增殖受到抑制,細胞培養(yǎng)上清液中SOD活性降低,LDH活性增加,細胞內(nèi)超氧陰離子水平增高,細胞凋亡率增加,并且這些作用與H2O2濃度和作用時間相關;但研究亦發(fā)現(xiàn)125μM H2O2作用一定時間后反而可能會促進細胞增殖,提高SOD活性,減少LDH外漏,降低細胞內(nèi)超氧陰離子含量以及細胞凋亡率。
結(jié)論:較低濃度H2O2作用條件下,隨著時間延長,HTR-8/SVneo細胞內(nèi)氧化和抗氧化天平逐漸偏向抗氧化一邊
6、;較高濃度時,隨著H2O2濃度增加以及作用時間延長,細胞發(fā)生氧化損傷趨于顯著。建立人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo氧化應激模型的合適條件為250μM H2O2作用4小時。氧化應激和脂質(zhì)過氧化對細胞增殖和凋亡所起的作用具有雙向性,其中細胞外信號轉(zhuǎn)導通路可能起到了重要調(diào)節(jié)作用,具體機制有待進一步研究。
第二部分制備小分子羧基和SOD修飾的碳納米管并研究其生物安全性
目的:制備小分子羧基修飾的多壁碳納米管(MWNT-COO
7、H)及SOD功能化改性的碳納米管(SOD-g-MWNT),檢測MWNT-COOH和SOD-g-MWNT的特性,評價二者的生物安全性。
方法:利用羧基功能化修飾MWNT制備小分子羧基修飾的碳納米管(MWNT-COOH),共價連接SOD制備SOD-g-MWNT,透射電鏡及傅立葉紅外光譜分析表征SOD-g-MWNT,熱重分析法(TGA)測定SOD接枝率,分光光度法檢測SOD-g-MWNT中SOD活性,CCK-8細胞增殖實驗檢測MWN
8、T-COOH和SOD-g-MWNT對細胞的毒性;利用熒光標記分子異硫氰酸熒光素(FITC)標記SOD和SOD-g-MWNT,通過流式熒光定量分析追蹤SOD和SOD-g-MWNT進入細胞的情況。
結(jié)果:經(jīng)羧基功能化修飾后,MWNTs長度大大縮短,并能很好的分散在水溶液中;通過酰胺鍵可以成功將SOD連接到MWNT-COOH上,接枝率約為11wt%,SOD活性率為82%; FITC-SOD-g-MWNT與細胞共培養(yǎng)24小時后的熒光陽
9、性率為68.57%,明顯高于FITC-SOD處理組;50μg/ml MWNT-COOH和SOD-g-MWNT作用24小時對細胞增殖均沒有影響。
結(jié)論:小分子羧基功能化修飾是提高MWNT生物相容性及細胞穿透性的一種有效方法;連接SOD后得到的SOD-g-MWNT不僅沒有明顯破壞SOD活性,還大大提高了細胞對SOD的攝取率;MWNT-COOH和SOD-g-MWNT二者均沒有表現(xiàn)出明顯細胞毒性。
第三部分 MWNT-COO
10、H和SOD-g-MWNT載藥對GSH抗氧化作用的影響
目的:在建立的滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo氧化應激模型基礎上,比較GSH、MWNT-COOH+GSH和SOD-g-MWNT+ GSH這三者在提高HTR-8/SVneo細胞對氧化損傷的耐受性、改善細胞氧化損傷中所起的不同作用。尋找提高抗氧化劑療效、避免其副作用的方法。
方法:MWNT-COOH和SOD-g-MWNT作為藥物載體吸附GSH,用GSH、MWNT-COOH
11、+GSH和SOD-g-MWNT+ GSH分別治療H2O2誘導的HTR-8/SVneo細胞氧化損傷模型,通過CCK-8細胞增殖實驗比較三者對氧化損傷細胞存活率的影響,通過流式分析檢測細胞內(nèi)ROS水平比較三者對細胞氧化損傷的改善作用。
結(jié)果:GSH對HTR-8細胞氧化損傷有治療作用;MWNT-COOH+GSH對氧化損傷的治療效果明顯優(yōu)于GSH,表現(xiàn)為細胞存活率增加,細胞內(nèi)ROS生成減少;SOD-g-MWNT+GSH治療組提高細胞存
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