可溶性H-2Db-IgG2b二聚體的構(gòu)建與表達.pdf

1、多發(fā)性硬化癥(MS)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的自身免疫性疾病，主要由髓鞘特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞所介導(dǎo)。其中CD4+髓鞘特異性T細(xì)胞被認(rèn)為是MS的主要介導(dǎo)細(xì)胞，然而，近年來發(fā)現(xiàn)髓鞘抗原特異性CD8+T細(xì)胞在MS的發(fā)病中也起到重要的作用，特別是在急性脫髓鞘損傷中，其頻率高于CD4+T細(xì)胞。因此，在探討MS發(fā)病機制中，CD8+T細(xì)胞同樣成為研究的焦點，如果能夠在抑制髓鞘特異性CD4+T細(xì)胞的同時特異性抑制髓鞘特異性CD8+T細(xì)胞的功能，有

2、望更有效的抑制MS的發(fā)生與發(fā)展。本室前期的研究結(jié)果顯示，pMHC 二聚體可作為T細(xì)胞的特異性配體有效的抑制CD8+T細(xì)胞的功能。本研究擬構(gòu)建并表達H-2Db/IgG2b 二聚體，并加載MOG35-55抗原肽形成MOG35-55/H-2Db 二聚體，該pMHC 二聚體可作為MOG35-55特異性T細(xì)胞的配體，以應(yīng)用于MS的動物模型實驗性自身反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)中，探討可溶性pMHC 二聚體誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞耐受、阻斷小鼠EAE 發(fā)生

3、的作用。論文分為2個部分，主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　 1．可溶性H-2Db/IgG2b 二聚體的構(gòu)建
　　 用RT-PCR的方法從C57BL/6(B6)小鼠淋巴細(xì)胞中擴增出H-2Dbα鏈的編碼基因，通過酶切位點將H-2Dbα鏈編碼基因和小鼠IgG2b Fc 段編碼基因連接，形成H-2Db/IgG2b 重組序列，然后分別將H-2Db/IgG2b 重組序列與小鼠輕鏈β2m 序列插入昆蟲桿狀病毒雙表達載體pFastBacTMD

4、ual的2個啟動子Pp10和PpH的下游，構(gòu)建獲得 [H-2Db/IgG2b]+pFastBacTMDual+β2m 重組質(zhì)粒，作為H-2Db/IgG2b 二聚體的表達載體。通過PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序，證實了重組質(zhì)粒中H-2Db/IgG2b 序列及β2m 編碼基因與預(yù)期序列一致。
　　 2．可溶性H-2Db/IgG2b 二聚體的表達、純化與鑒定
　　 將 [H-2Db/IgG2b]+pFastBacTMDua

5、l+β2m 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，得到重組的穿梭質(zhì)粒Bacmid+[H-2Db/IgG2b]。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將其轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞系Sf9中，收獲上清得到成熟桿狀病毒顆粒，再用此病毒顆粒大量感染Sf9細(xì)胞，收集富含H-2Db/IgG2b 二聚體的病毒感染上清，經(jīng)SPA 親和層析得到濃縮純化的可溶性H-2Db/IgG2b 二聚體。利用H-2Db 特異性的TIB-126 抗體以及抗IgG2b Fc 抗體進行雙抗夾心ELISA 鑒