腎小管上皮細胞中Cdc42相關蛋白4對E-cadherin和Occ ludin表達的影響及調節(jié).pdf

1、腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)進展到終末期所發(fā)生的不可避免的結果。腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化(EMT)被認為是其中重要的事件之一,在 EMT的過程中,上皮標志物如E-鈣粘蛋白(E-cadherin),閉合蛋白(occludin)等表達下降,甚至丟失。E-cadherin主要與β-連環(huán)素(β-catenin)一起形成細胞粘附復合體,介導細胞之間的粘附,β-catenin是重要的

2、E-cadherin表達調節(jié)分子,其入核后可激活抑制E-cadherin表達相關基因的啟動子(如Snail,Slug等);occludin則為細胞緊密連接的重要組成蛋白,介導細胞之間的緊密連接,維持上皮細胞的極性,其表達可以通過極性蛋白 Par6來調節(jié)。有研究表明,轉化生長因子-beta1(TGF-β1)是重要的促纖維化因子,可通過經(jīng)典的Smad信號通路和其他非 Smad信號通路(包括 MAPK,PI3K/Akt,ERK,RhoGTPa

3、se等)來完成其對腎間質纖維化的調節(jié)作用。本文研究的目的蛋白 Cdc42相關蛋白(Cdc42-interacting protein,CIP4)是 RhoGTPase蛋白家族成員之一,是 Cdc42的下游效應蛋白,參與細胞骨架蛋白肌動蛋白(actin)的調節(jié),對維持細胞正常的形態(tài)起重要的作用。我們的研究結果表明:無論在大鼠5/6腎切除模型還是小鼠單側輸尿管結扎(Unilateral ureteral obstruction, UUO)的

4、模型中,與假手術組相比較,CIP4的表達均上調,且主要分布在腎小管側基底膜,細胞之間的連接處,而E-cadherin和occludin的表達則下降。體外實驗我們使用TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞作為主要研究對象,CIP4的表達同樣上升,并伴隨有 E-cadherin和occludin表達的下調,與體內實驗結果一致。在無 TGF-β1的刺激下單獨高表達 CIP4,亦可出現(xiàn)上述相關蛋白的變化。同時我們還觀察到,無論是在TGF-β1的誘導下

5、還是 CIP4高表達情況下,β-catenin與 CIP4均存在相互作用,但是細胞總蛋白中β-catenin的表達無明顯變化,在核蛋白中的表達則增加。使用特異性siRNA敲除 CIP4后,核蛋白內β-catenin表達減少,同時 E-cadherin表達恢復,甚至高于對照組的表達水平。進一步的研究表明,在高表達 CIP4的情況下特異性敲除β-catenin,E-cadherin的表達并無明顯的變化。另一方面,在 TGF-β1誘導和CIP

6、4高表達的兩組細胞中,極性蛋白 Par6(Polarity protein,Par6)表達無明顯的統(tǒng)計學差異,但這兩組細胞中均存在 CIP4與 Par6的相互作用,但是在對照組細胞內是則未觀察到該現(xiàn)象。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn),CIP4可通過促進β-catenin入核調節(jié) E-cadherin的表達,同樣,CIP4也可能通過 Par6參與 occludin表達的調節(jié)。
　　第一部分腎間質纖維化模型中CIP4的表達與分布
　　目的：

7、探討在 SD大鼠5/6腎切除模型以及Balb/c小鼠UUO模型中CIP4的表達量的變化與分布。
　　方法：SD大鼠5/6腎切除法建立腎臟纖維化模型,Blab/C小鼠通過結扎單側輸尿管建立腎臟纖維化模型。前者采集各組的血清檢測肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)值;兩組均根據(jù) Masson染色結果觀察腎臟組織纖維化程度;用免疫組織化學染色觀察CIP4在模型組和假手術組的表達和分布。Western blotting檢測 E-cadheri

8、n、occludin、β-catenin、Par6和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth nuscke actin,α-SMA)蛋白表達變化。
　　結果：5/6腎切除模型中,手術組動物 Scr,BUN水平高于假手術組;手術組 Masson染色顯示腎間質明顯纖維化,部分腎小球硬化,腎小管萎縮,小管上皮細胞脫落,CIP4表達量上調,主要分布在腎小管上皮細胞側基底膜細胞連接處。UUO模型中,手術組 Masson染色顯示腎間質有較多纖維組

9、織形成,部分腎小管擴張,部分腎小管萎縮、上皮細胞脫落。CIP4表達也上調,主要分布在腎小管上皮細胞區(qū)域。兩種動物模型westen blotting結果均顯示,CIP4表達量增加(分別為假手術組的3.91倍和3.64倍)伴隨著 E-cadherin及occludin表達的下降,α-SMA表達增加(P<0.05),β-catenin和Par6表達量無明顯變化。
　　結論：CIP4在纖維化的組織中表達明顯增加,且主要分布于腎小管上皮細胞

10、,提示 CIP4與腎間質纖維化關系密切。
　　第二部分 TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化中CIP4的表達與分布
　　目的：探討大鼠腎小管上皮細胞(Normal rat kidney52E,NRK52E細胞)在 TGF-β1誘導下 CIP4蛋白表達量的變化。
　　方法：NRK52E細胞在含有 TGF-β1(10ng/ml)的培養(yǎng)液中培育72小時,光學電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化;提取細胞蛋白,Western blo

11、tting檢測CIP4、E-cadherin、occludin、β-catenin、Par6以及α-SMA蛋白表達的變化。
　　結果：對照組細胞呈鋪路石樣外觀,細胞間連接緊密,細胞形態(tài)規(guī)則;模型組細胞體積變大,形狀不規(guī)則,細胞間連接松散,間隙變大。Western blotting結果顯示與對照組相比,TGF-β1刺激組的NRK52E細胞 CIP4表達上調,為對照組的1.72倍,同時α-SMA蛋白表達也增高,E-cadherin及o

12、ccludin表達量減少(P<0.05),β-catenin和Par6表達量無統(tǒng)計學差異。
　　結論：體外實驗與體內模型所得到的結果一致,提示 CIP4參與 TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化進程。
　　第三部分 CIP4對 E-cadherin表達的影響與調節(jié)
　　目的：探討在腎小管上皮細胞轉分化的過程中,CIP4對β-catenin核轉位的調控,以及對 E-cadherin表達的影響。
　　方法：用脂質體

13、2000將 pcDNA4.0/CIP4質粒瞬時轉染至 NRK52E細胞內,Western blotting檢測相關各蛋白的表達;免疫熒光法檢測 CIP4及β-catenin在細胞內的共定位,用共聚焦顯微鏡觀察;免疫沉淀法檢測 CIP4與β-catenin的相互作用;用特異性 siRNA敲除相關蛋白的表達。
　　結果：在 TGF-β1刺激組中,CIP4和β-catenin在核蛋白中的表達均增加,分別為對照組的1.82倍和1.59倍。

14、在共聚焦顯微鏡下觀察,免疫熒光結果顯示正常組 CIP4與β-catenin主要分布于細胞膜,且在細胞膜上存在部分共定位,模型組中,CIP4與β-catenin在細胞膜上分布減少,細胞核內表達增多,細胞核內存在部分共定位現(xiàn)象;同時用免疫沉淀法檢測,在這兩組細胞中CIP4和β-catenin均存在著相互作用。在倒置顯微鏡下觀察到,對照組細胞形態(tài)規(guī)則,呈鋪路石樣的外觀,細胞間連接緊密;轉染了CIP4質粒的細胞細胞形態(tài)不規(guī)則,連接松散,體積變大

15、,其改變與 TGF-β1刺激后的細胞相類似;而轉染了pcDNA4.0空載體的細胞則未發(fā)生上述改變。單獨轉染CIP4目的基因質粒的NRK52E細胞中,CIP4與α-SMA表達上調,E-cadherin表達減少(P<0.05),β-catenin的表達無明顯變化。用特異性的siRNA沉默 CIP4的表達后, CIP4的表達量只為原來40％。隨著 CIP4表達的下降,E-cadherin表達升高,甚至高于對照組(P<0.05),同時β-cat

16、enin的表達仍無明顯的變化。NRK52E細胞轉染 CIP4質粒后,核蛋白中CIP4與β-catenin表達均增加(P<0.05),特異性敲除 CIP4后,CIP4在核蛋白中表達下降,β-catenin的表達也下調(P<0.05)。將β-catenin特異性 siRNA轉染至 NRK52E細胞,β-catenin的表達量下降為對照組的65％,E-cadherin與 CIP4表達量無明顯改變,在已轉染高表達 CIP4質粒的細胞中再轉染特異

17、性的β-catenin siRNA,與對照組相比,只轉染 CIP4質粒組的細胞,E-cadherin表達隨 CIP4表達的增高而下降(P<0.05),而在既轉染了CIP4質粒也轉染了β-catenin siRNA的細胞中, E-cadherin的表達恢復至對照組水平(P<0.05)。
　　結論：CIP4可通過促進β-catenin入核,從而調節(jié) E-cadherin的表達。
　　第四部分 CIP4對 occludin表達的影

18、響
　　目的：探討 NRK52E細胞高表達 CIP4后對緊密連接蛋白 occludin表達的影響及與極性蛋白 Par6之間的相互作用關系。
　　方法：用脂質體2000將 pcDNA4.0/CIP4質粒瞬時轉染至 NRK52E細胞中,Western blotting檢測相關各指標的變化;用免疫沉淀法檢測 CIP4與 Par6之間的相互作用。
　　結果：單獨高表達 CIP4,occluidn表達下降,α-SMA蛋白表達量上