聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物(前體藥物)給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、癌癥是嚴重危害人類健康的主要疾病之一。攻克癌癥一直是世界矚目的研究課題。世界衛(wèi)生組織調(diào)查表明,癌癥患者正逐年增加,我國癌癥發(fā)病人數(shù)在120萬左右,每年死于癌癥的人數(shù)多達90萬人,與此同時,癌癥的藥物治療近年來取得迅猛發(fā)展,新的抗癌藥物不斷涌現(xiàn)。喜樹堿、紫杉醇以及維生素甲類化合物抗癌作用的證實是90年代抗癌藥物的幾大發(fā)現(xiàn)。喜樹廣泛分布于長江、川南、貴州以及云南等地區(qū),資源十分豐富。喜樹堿是從喜樹中提取的一種生物堿,對喜樹堿進行研究可以促進

2、抗腫瘤藥物的發(fā)展,使得資源得到充分的利用。
　　 天然喜樹堿具有顯著的抗腫瘤活性,對消化道腫瘤、白血病、膀胱癌、卵巢癌等有強效的治療效果,但是它易引起骨髓抑制,嘔吐,尿血等毒副作用,且喜樹堿不溶于水,難溶于酯,不便制成適宜的劑型,進一步限制了它應(yīng)用。
　　 輪烷是由一個或多個環(huán)狀分子作“轉(zhuǎn)子”(如CD)和一條或多條線形分子“作軸”(PEG)由非共價鍵組裝成的超分子體系,當線狀分子兩端用大基團封閉時稱為輪烷。由于組成聚輪烷

3、上的CD和PEG與生物體有良好的相容性,具有很多功能化的位點,可以將藥物包合在腔內(nèi),也可以鍵接在外側(cè)的羥基上。并且還可將這些功能化的(準)輪烷鍵接到具有靶向作用的物質(zhì)表面,實現(xiàn)靶向給藥。已經(jīng)有一些研究者將茶堿,肽類化合物鍵接在CD(準)輪烷上后,研究其釋放規(guī)律,表明可以實現(xiàn)控制釋放。
　　 抗腫瘤藥物臨床使用的局限性往往表現(xiàn)在其對腫瘤細胞特異性選擇低,對正常細胞損傷較大,容易產(chǎn)生毒副作用等缺點,因此,一個理想的給藥系統(tǒng),應(yīng)該達到

4、給藥以后,載體將藥物選擇性的濃集定位于靶組織,靶器官,靶細胞或者細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的給藥系統(tǒng)。并且要求有一定濃度的藥物滯留相當時間,以便發(fā)揮藥效,而載體無遺留的毒副作用。藥物的低毒和高效對疾病的臨床治療十分重要。
　　 近年來,藥物靶向傳遞的研究越來越受到研究者的重視。自從發(fā)現(xiàn)葉酸受體在絕大多數(shù)惡性腫瘤細胞膜內(nèi)有大量表達,而正常細胞很少有表達以來,葉酸/葉酸受體介導靶向傳遞的研究成為該領(lǐng)域的熱點問題。葉酸是小分子量維生素,相對于單分子抗

5、體等蛋白質(zhì),具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價格低廉、無免疫原性等特點；而且葉酸與葉酸受體結(jié)合力強,能被高效介導進入腫瘤細胞,是一種很有應(yīng)用價值的靶向物質(zhì)。結(jié)合到藥物緩釋的要求,人們又將葉酸通過化學鍵合連接到藥物載體上,如脂質(zhì)體、多聚物、蛋白質(zhì),以及它們制成的納米顆粒,這樣就能效地同時實現(xiàn)抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的靶向識別和藥物緩釋,避免藥物對正常細胞的傷害,提高腫瘤的治療效果。
　　 因此,我們提出設(shè)想,合成新型的以聚輪烷(PR)為載體的喜樹堿新型

6、給藥系統(tǒng),改善喜樹堿溶解度差的問題,提高藥物的溶解度。聚輪烷載體為大分子物質(zhì),在機體內(nèi)可被單核-巨噬細胞系統(tǒng)吞噬,通過增強滲透和滯留(EPR)效應(yīng)被動靶向并選擇性的滯留于腫瘤組織周圍；在聚輪烷(PR)載體上鏈接葉酸,利用葉酸受體對靶向大分子偶聯(lián)物的攝取和對體內(nèi)腫瘤分布的選擇性的特征,減少臨床使用中出現(xiàn)的毒副作用大的問題,促進其腫瘤特異性靶向作用。確保藥物腫瘤靶向性的效果,為臨床治療提供有利依據(jù)。
　　 為系統(tǒng)研究聚輪烷-喜樹堿偶

7、聯(lián)物,以α-環(huán)糊精(α-CD)、PEG-BA(4000)、為主體,制備了葉酸/Tyr兩種不同大分子封端的自組裝超級分子聚輪烷作為藥物載體；通過活化載體CD上的羥基,鏈接上喜樹堿,制備聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物,并運用紅外、1H NMR等手段對進行了結(jié)構(gòu)驗證,結(jié)果表明,成功合成載體材料(PR)及PR-CVT偶聯(lián)物給藥體系。
　　 通過考察聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物體外釋放情況,繪制百分累積釋放度曲線,以反映其體外的釋藥趨勢,實驗結(jié)果表明,偶聯(lián)

8、物在3、6、12、24小時聚輪烷一喜樹堿偶聯(lián)物在PBS溶液中緩慢釋放,沒有發(fā)現(xiàn)突釋的現(xiàn)象,經(jīng)過36、48、72、96、120、144小時的觀察,偶聯(lián)物在120小時后釋放達到80％以上。144小時時,釋放將近90％。
　　 運用SPSS13.0軟件(Curve Estimation)功能對累積百分釋放率結(jié)果進行各種模型優(yōu)度檢驗,對累積百分釋放率結(jié)果進行各種曲線模型的擬合,能夠更好的通過藥物的溶出度測定進行真實、客觀的藥物質(zhì)控及評價

9、。本實驗合成的兩種偶聯(lián)物,以三次模型(CUB)為最佳釋放模型。其R2分別為0.995％及0.998％。
　　 采用HPLC法以流動相乙腈:水(30:70)；流速1ml/min；檢測波長254nm；柱溫為室溫；進樣量10μl進行檢測,在此色譜條件下,喜樹堿出峰時間為14.5min。各峰分離良好。喜樹堿、FA-PR-CPT及Tyr-PR.CPT偶聯(lián)物中喜樹堿的溶解度結(jié)果分別為28μg/ml和187μg/ml、195μg/ml。結(jié)果表

10、明,聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物的溶解度較喜樹堿提高了約7倍。證實偶聯(lián)物能夠有效的改善喜樹堿溶解度低的缺點,這可能是由于聚輪烷載體中的PEG及CD等親水性分子的存在,CD外部具有豐富的醇羥基,親水性較強,可增加難溶性藥物的溶解度；且外部醇羥基經(jīng)進一步活化后,可與多種基團形成醚化、酯化、氧化等化學反應(yīng),使環(huán)糊精的分子外表面有新的功能團,從而進一步在CD上加載藥物。PEG具有高度的親水性,可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子,改變它們在水溶液中的生

11、物分配行為和溶解性,提高藥物的溶解性,大大提高了聚輪烷一喜樹堿偶聯(lián)物的親水性,使得其溶解度較喜樹堿單體顯著提高,明顯改善了喜樹堿溶解性難的缺點。
　　 含量測定表明,喜樹堿在0.017～17μg范圍內(nèi)線性良好。流動相乙腈:水(30:70)；流速1ml/min；檢測波長254nm條件下,樣品分離度較好,無干擾。結(jié)果顯示,載藥量約為8％。與文獻報道一致。
　　 為考察聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物體外細胞增殖抑制,采用了MTT法檢測不

12、同濃度聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物對卵巢癌A2780細胞的作用,計算抑制率及IC50值,結(jié)果表明,聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物對卵巢癌細胞株A2780的抑制作用,隨濃度增大,其抑制率增高,在作用的各個時間點,偶聯(lián)物組抑制率均小于喜樹堿單獨給藥組。提示偶聯(lián)物較喜樹堿的毒副作用降低,喜樹堿、FA-PR-CPT組,Tyr-PR-CPT組的IC50分別為5.2、34.8 and 97.8mg/L,FA-PR-CPT組的IC50比Tyr-PR-CPT組低約2.8

13、倍,其因為可能是因為葉酸封端的聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物與葉酸受體陽性細胞A2780細胞膜表面葉酸受體特異性結(jié)合后,通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞,使藥物進入細胞膜加快,從而提高了細胞毒性,FA-PR-CPT組IC50結(jié)果提示其具有腫瘤細胞特異性靶向作用。
　　 鏡下觀察不同濃度偶聯(lián)物對細胞形態(tài)學改變的影響,結(jié)果表明經(jīng)過喜樹堿及聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物處理后,普遍出現(xiàn)細胞凋亡顯著,失去正常生長形態(tài),其生長明顯受到抑制。
　　 流式細胞儀

14、檢測偶聯(lián)物作用后細胞凋亡情況及對細胞周期的影響,結(jié)果顯示隨著給藥濃度增加,S期細胞的比例也不斷上升；隨著作用時間的延長S期細胞比例也隨之明顯增加。實驗結(jié)果表明喜樹堿及其偶聯(lián)物對卵巢癌A2780細胞周期有阻滯作用,將細胞阻滯于S期,造成DNA損傷,抑制DNA復制,使細胞不能進入G2/M期進行分裂增殖,提示其抑制細胞增殖的機制可能與影響細胞周期有關(guān)。
　　 考察偶聯(lián)物對人肺腺癌A549細胞株體外細胞增殖抑制作用。結(jié)果表明,喜樹堿、F

15、A-PR-CPT組,Tyr-PR-CPT組的IC50分別為4.9、33.9 and 39.5mg/L,FA-PR-CPT組,Tyr-PR-CPT IC50無顯著性差異。提示葉酸偶聯(lián)物可能是通過葉酸受體介導,從而特異性的靶向于葉酸陽性受體腫瘤細胞內(nèi)的。而對于葉酸受體陰性的細胞株,則無明顯的受體靶向性情況。
　　 對CPT及偶聯(lián)物進行了小鼠急性毒性試驗及體內(nèi)抗腫瘤試驗,結(jié)果表明,偶聯(lián)物組最大劑量5mg/10g時,達到100％死亡,最

16、低劑量組5mg×0.74/10g老鼠無死亡,高劑量組毒副作用明顯,低劑量組毒副作反應(yīng)輕緩,2～3天恢復正常,小鼠沒有死亡。測得CPT組LD50為1.0573mg/10g偶聯(lián)物LD50為2.30 mg/10g及2.45 mg/10g。
　　 采用S180荷瘤小鼠進行體內(nèi)抗腫瘤試驗,結(jié)果表明,偶聯(lián)物治療組對S180荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用,腫瘤體積及重量與荷瘤模型組相比,有顯著性差異。CPT陽性對照組、FA-PR-CPT組、Ty

17、r-PR-CPT組抑瘤率分別為71％、81％及76％。病理學結(jié)果顯示治療組的腫瘤細胞在生長及浸潤都較荷瘤組淺,病理切片可見明顯的抑制生長浸潤及血管數(shù)目,提示其抗腫瘤機理可能是通過減少供血從而導致腫瘤細胞壞死。
　　 針對聚輪烷載體的優(yōu)勢以及喜樹堿的作用效果、現(xiàn)有劑型的缺點等方面,本實驗合成了以聚輪烷為載體的聚輪烷-喜樹堿偶聯(lián)物給藥體系,并從偶聯(lián)物的表征,含量、溶解度以及體外釋放度的測定、體內(nèi)外抗腫瘤試驗的等方面進行了研究。研究結(jié)