TNFR Ⅱ-Fc對類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4+CD25+Treg細胞亞群及其配體GITR表達的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景：
　　類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥、骨破壞、自身免疫過度活化為特征，至今發(fā)病機制未明，且沒有比較理想的根治方案。RA的自身免疫紊亂包括細胞亞群失調(diào)和T細胞異?；罨约捌鋵?dǎo)致的一系列炎癥性細胞因子激活，大量證據(jù)表明RA患者關(guān)節(jié)滑液中高表達CD4+、CD8+T細胞，表明T淋巴細胞參與了RA免疫學異常的發(fā)病機制，已有研究表明調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是

2、具有免疫調(diào)節(jié)功能的成熟T細胞亞群,參與誘導(dǎo)和維持機體外周免疫耐受,其中最具調(diào)節(jié)潛力的細胞亞型存在于CD4+并天然表達CD25的T細胞亞群中，這群細胞經(jīng)體外非特異性和體內(nèi)特異性抗原激活后,通過細胞接觸依賴或細胞因子非依賴方式抑制自身反應(yīng)性T細胞或效應(yīng)性T細胞增殖/應(yīng)答反應(yīng),發(fā)揮免疫抑制活性,進而控制過度的免疫應(yīng)答、維持免疫穩(wěn)態(tài)。研究表明多種自身免疫性疾病都存在著CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量和(或)功能的異常，過繼轉(zhuǎn)移CD4+CD25

3、+Treg細胞可防止這些自身免疫病的發(fā)生，其中已有報道指出在類風濕關(guān)節(jié)炎及幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者外周血中存在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，然而活動期RA患者使用生物制劑TNF-α受體抗體融合蛋白治療后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的變化情況尚未有足夠的研究報道。
　　近年研究表明，胞內(nèi)表達叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)目前被認為是Treg最具特異性的標志,而且Foxp3的表達在調(diào)節(jié)Treg發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用，阻斷正常小

4、鼠CD4+CD25+Treg表達Foxp3后，CD4+CD25+Treg表面CD25，CD45RB，CTLA-4及GITR等表達水平下調(diào)，其負向調(diào)節(jié)活性明顯下降；而高表達Foxp3轉(zhuǎn)染小鼠的CD4+CD25+Treg高表達CD25，CD45RB，CTLA-4及GITR，其負向調(diào)節(jié)活性亦較正常小鼠CD4+CD25+Treg強，表明Foxp3可能為小鼠Treg細胞發(fā)育和獲得免疫調(diào)節(jié)活性的決定因素，但是在人類，F(xiàn)OXP3是否是調(diào)節(jié)T細胞發(fā)揮免

5、疫耐受的特異性標志仍然有爭議。因此，深入研究CD4+CD25+Foxp3+在活動期RA關(guān)節(jié)損傷中的作用和機制，從調(diào)節(jié)性T細胞水平上確定新的治療靶點，具有重要的理論及應(yīng)用意義。
　　進一步研究表明，Treg細胞上有許多重要的表面分子，其中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)能反轉(zhuǎn)CD4+CD25+Treg細胞對CD4+

6、CD25-T細胞的抑制作用，在Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用。GITR和其配體(GITRL)在免疫調(diào)節(jié)中的作用特別是與Treg的相關(guān)性受到免疫學研究者的高度關(guān)注。許多動物模型都驗證了GITR信號協(xié)同T淋巴細胞參與免疫耐受維持，對于器官特異性自身免疫性疾病來說，阻斷GITR/GITRL的相互作用有助于疾病的治療；另一方面,增強GITR/GITRL共刺激信號的作用則有助于機體清除感染、發(fā)揮抗腫瘤免疫的作用。因此,深入研究GITR/G

7、ITR共刺激活化作用和抑制Treg細胞活性機制，已成為研究自身免疫性疾病發(fā)病機制的新方向。
　　另外，在過去的10年研究中，腫瘤壞死因子(turnout necrosis factor，TNF)是RA的發(fā)病過程中最重要的炎癥細胞因子之一，以TNF/TNFR為治療靶向的生物制劑治療成為RA治療新的突破點，盡管新的生物制劑的治療及研究不斷發(fā)展，但其對RA治療中的藥物機制研究還需要作進一步探討，鑒于此，本課題還研究活動期RA患者在接受生

8、物制劑TNF-α受體抗體融合蛋白（TNFRⅡ-Fc）前后RA患者Foxp3+CD4+CD25+Treg、GITR+CD4+CD25+ Treg及GITRmRNA的變化及其意義。
　　研究目的：
　　1.觀察活動期類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表面FOXP3轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，探討CD4+CD25+ FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞在RA發(fā)生及發(fā)展中的免疫調(diào)節(jié)及抑制作用。
　　2.觀察活動期類風濕關(guān)

9、節(jié)炎(RA)患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表面GITR表達情況及外周血單個核細胞GITRmRNA的水平，探討GITR對類風濕關(guān)節(jié)炎Treg細胞免疫調(diào)控的作用。
　　3.研究RA患者在腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白（TNFRⅡ-Fc）治療前后CD4+CD25+FOXP3+Treg、GITR+CD4+CD25+ Treg及GITRmRNA表達的變化，探討腫瘤壞死因子（TNF-α）在RA發(fā)病機制中對這一T細胞亞群的影響以及二者之

10、間的相互作用，從而為深入研究TNF-α及調(diào)節(jié)性T細胞在RA發(fā)病中的作用提供線索。
　　方法：
　　(1)選擇40例活動期中重度類風濕關(guān)節(jié)炎患者（包括未經(jīng)傳統(tǒng)DMARDS治療8例，經(jīng)傳統(tǒng)DMARDS甲氨蝶呤治療病情緩解者3例和治療后效果不佳者29例），以及正常對照組40例，采用流式細胞術(shù)檢測外周血FOXP3+CD4+CD25+Treg及GITR CD4+CD25+Treg細胞的表達。
　　(2)將兩組患者按隨機、雙盲、平

11、行、安慰劑對照的原則分為TNFRⅡ-Fc、MTX聯(lián)合治療組和MTX對照治療組，采用流式細胞術(shù)檢測比較治療12周后外周血FOXP3+CD4+CD25+Treg及GITR CD4+CD25+Treg細胞的表達，探討TNFRⅡ-Fc治療對RA患者CD4+CD25+Treg及其相關(guān)配體GITR的變化。
　　(3)分離外周血單個核細胞，采用反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測兩組患者治療前后外周血單個核細胞GITRmRNA含量。
　　(4)比較兩組患者

12、治療不同時期疼痛指數(shù)(VAS法)、DAS28(疾病活動指數(shù))、HAQ平均分，探討TNFRⅡ-Fc治療對活動期RA患者病情臨床及實驗室指標改善的相關(guān)性。
　　(5)計量資料組間比較采用配對設(shè)計的t檢驗。
　　結(jié)果：
　　(1)活動期類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血 CD4+CD25+ FOXP3+Treg表達比例及熒光強度均顯著低于健康對照組[(5.45±1.37)％vs(7.48±1.46)%，(1324.8±20.51)vs(

13、1585±15.20)，P<0.01]；TNFRⅡ-Fc加MTX聯(lián)合治療12周后，CD4+CD25+ FOXP3+細胞比例及熒光強度顯著高于治療前[(6.96±1.17)%vs(5.24±1.61)%，(1570.1±32.86)vs(1324.±15.01)，P<0.01]。聯(lián)合治療組CD4+CD25+FOXP3+細胞比例及熒光強度增高的幅度顯著高于MTX治療組[(6.96±1.17)% vs(5.57±0.67)%，(1570.1±

14、32.86)vs(1340.0±44.77)，P<0.01]。
　　(2)治療12周后，流式細胞術(shù)檢測，GITR+CD4+CD25+Treg細胞比值在聯(lián)合治療組、MTX治療組與健康對照組之間相似[(2.01±0.15)%vs(1.95±0.02)% vs(1.98±0.20)%，P>0.05]，差異無統(tǒng)計學意義。
　　(3)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組患者外周血PBMCs中GITR mRNA含量明顯低于對照組[(0.

15、81±0.88) vs(4.61±7.45)，P=0.004，P<0.05]。
　　(4)治療12周后，聯(lián)合治療組VAS評分、DAS28評分、HAQ平均分均優(yōu)于甲氨蝶呤組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　(1)本研究顯示活動期類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血 CD4+CD25+ FOXP3+Treg表達顯著低于健康對照組，提示CD4+CD25+FOXP3+Treg與類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；TNFRⅡ-F

16、c聯(lián)合MTX聯(lián)合能顯著提高CD4+CD25+ FOXP3+Treg表達；聯(lián)合治療組CD4+CD25+FOXP3+Treg表達顯著高于MTX治療組，提示TNFRⅡ-Fc可提高活動期RA患者血中CD4+CD25+ FOXP3+Treg細胞表達，可能是其治療RA的一個重要機制。
　　(2)TNFRⅡ-Fc治療能降低RA患者外周血PBMCs中GITRmRNA表達水平，通過抑制GITR功能發(fā)揮Treg免疫調(diào)節(jié)可能是其治療RA的一個重要機制；

17、進一步研究顯示TNFRⅡ-Fc治療前后活動性RA患者GITR+CD4+CD25+Treg細胞比例無明顯變化，GITR使調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制活性喪失方面的研究仍有待通過完善GITR在體外與效應(yīng)性T細胞的共刺激功能試驗及相關(guān)影響因子檢測加以驗證。
　　(3) TNFRⅡ-Fc較傳統(tǒng)的免疫抑制劑MTX顯著降低了活動期RA患者的VAS評分、DAS28評分、HAQ平均分，明顯改善了了RA患者的疾病活動度。
　　(4)本研究建立了CD4